胃癌組織中ERCC1基因的高甲基化及DNMT1的表達

張 杰，張 梅，姜相君

大連醫科大學附屬青島市市立醫院消化內二科，山東 青島 266011

胃癌組織中ERCC1基因的高甲基化及DNMT1的表達

張 杰，張 梅，姜相君

大連醫科大學附屬青島市市立醫院消化內二科，山東 青島 266011

目的 探討人切除修復交叉互補基因1(excision repair cross-complementing gene 1，ERCC1)基因啟動子CpG島甲基化和DNA甲基轉移酶1(DNA methyltransferase 1，DNMT1)基因的表達與胃癌發生的關系及臨床意義。方法 采用甲基化特異性PCR(MSP)技術檢測60例胃癌組織及其相應癌旁正常組織中ERCC1基因啟動子區甲基化狀態。同時應用逆轉錄聚合酶鏈反應(real-time RT-PCR)法和免疫組化(IHC)SP法分別檢測ERCC1及DNMT1基因的mRNA和蛋白表達水平。結果 胃癌組織中ERCC1基因啟動子CpG島甲基化陽性率為68.3%，明顯高于相應的癌旁正常組織(23.3%)。胃癌組織中ERCC1 mRNA陽性率顯著低于癌旁正常組織(31.7%vs71.7%，P<0.05)，而胃癌組織中DNMT1 mRNA陽性率明顯增高，差異均有統計學意義(78.3%vs16.7%，P<0.05)。ERCC1 mRNA 陰性表達的胃癌組織中基因啟動子的甲基化率較ERCC1 mRNA陽性表達者明顯升高，差異具有統計學意義(92.7%vs15.8%，P<0.001)。結論 ERCC1基因啟動子CpG島高甲基化及DNMT1基因表達上調可能參與胃癌的發生與發展。DNMT1可能調控ERCC1基因的甲基化。

胃癌；ERCC1基因；甲基化；DNMT1

在消化系統惡性腫瘤中，胃癌是主要的致死疾病之一，大部分患者診斷時已經為晚期，所以胃癌的早期診斷尤為重要。胃癌發生與發展是一個多基因、多步驟參與的復雜過程，其中包括癌基因的過度表達與抑癌基因的表達失活等，表觀遺傳學機制起著重要作用，而其中最常見就是的DNA甲基化[1]。越來越多的研究[2-4]證實，抑癌基因啟動子區CpG島的高甲基化參與腫瘤的發生、發展過程。DNA甲基化是指在甲基化轉移酶的催化下DNA序列中的腺嘌呤(A)或胞嘧啶(C)堿基與甲基發生共價結合的過程[5]，DNMT1在甲基化過程中起最主要的、維持甲基化狀態的作用[6]。相關研究已經表明：在胃癌組織中ERCC1基因的表達較正常的胃黏膜組織有所降低[7-10]。胃癌組織中ERCC1基因的低表達或許與DNMT1存在一定的關系。本研究采用甲基化特異性PCR檢測60例胃癌組織及其相應的癌旁正常組織中ERCC1基因啟動子CpG島甲基化狀態；同時應用逆轉錄聚合酶鏈反應(real-time RT-PCR)法和免疫組化(IHC)SP法分別檢測ERCC1及DNMT1基因的mRNA和蛋白表達水平，并初步探討其與胃癌發生、發展的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集青島市市立醫院2014年1月-2014年10月普外科切除的新鮮胃腫瘤標本60例，標本經病理組織學確診為原發性胃癌，術前未行放化療等抗腫瘤治療，擁有完整的臨床資料。60例患者中男37例，女23例，年齡35～75歲，中位年齡55歲。胃癌組織取自癌灶中央非壞死區域，癌旁正常組織取距離癌組織5 cm以上，經病理證實，組織均正常。所有標本均于術后半小時內獲得，液氮速凍后-80 ℃冰箱保存。

1.2 主要試劑基因組DNA提取試劑， DNA甲基化試劑盒，Trizol、RT-PCR反應試劑盒，免疫組化試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 組織DNA提取和甲基化修飾：每個樣本取30 mg左右組織塊進行勻漿處理，參照組織基因組DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA，紫外分光光度儀測定 DNA 濃度和純度，OD260/OD280 比值在1.8～2.0之間的DNA用于甲基化修飾。各樣本DNA取800 ng參照EZ DNA甲基化試劑盒說明書進行甲基化修飾，修飾好的DNA洗脫后保存于-20 ℃冰箱中。

1.3.2 引物設計：根據ERCC1基因啟動子區CpG島DNA序列，設計ERCC1甲基化引物為：M，F:5′-TTTAGGATTATAGAGAGTAGCGCGA-3′，R:5′-CAAAAAAAATAAAAACGATACAACG-3′。非甲基化引物：U，F:5′-TTTAGGATTATAGAGAGTAGTGTGA-3′,R:5′-AAAAAAATAAAAACAATACAACACC-3′。

1.3.3 甲基化特異性PCR(methylation specific PCR，MSP)：取修飾后的DNA 2 μl進行MSP反應。反應體系按照PCR試劑盒的推薦量25 μl體系進行，其中PCR混合液12.5 μl，上下游引物各0.5 μl，修飾后的DNA 2 μl，滅菌雙蒸水9.5 μl。MSP循環條件為：97 ℃預變性5 min后，95 ℃變性45 s，甲基化引物和非甲基化引物分別在57 ℃、55 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，共40個循環，最后于72 ℃延伸10 min。擴增后，每種PCR產物取10 μl在2.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，染色用溴化乙錠，并在紫外光照射下觀察分析。

1.3.4 組織RNA提取：取0.5 g組織用研磨棒充分研磨，然后放入Trizol(日本TakaRa公司)1 ml中，按照試劑說明書進行操作，得到的RNA經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，并用核酸蛋白分析儀檢測其濃度及其A值，測得1.8～2.0，符合純度要求，置于-80 ℃冰箱保存。

1.3.5 逆轉錄-多聚合酶鏈反應(real-time RT-PCR)：取RNA 1 μg，嚴格按照逆轉錄試劑盒(日本TaKaRa公司)說明書操作合成cDNA。用β-actin作為內參進行PCR，其上游引物為：5′-CCTTCCTTCCTGGGCATGGAGTCCTG-3′,其下游引物為：5′-GGAGCAATGATCTTGACTTC-3′；ERCC1上游引物為：5′-TCACACAACCTGCACCCAGACTAC-3′，下游引物為：5′-CTGACTGTCTTTGTTGACTGA-3′；DNMT1上游引物為：5′-CGGTTCTTCCTCCTGGAGAATGTCA-3′，下游引物為：5′-CACTGATAGCCCATGCGGACCA-3′，引物均由上海生工生物工程技術有限公司合成。PCR反應體系為20 μl，由SYBR? Premix Ex TaqTM Ⅱ(×2)10.0 μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μl，cDNA模板2.0 μl，ROX Reference Dye(×50)0.4 μl，滅菌蒸餾水6.0 μl。PCR反應參數：95 ℃預變性30 s，95 ℃ 5 s、65 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40個循環。PCR產物于2.5%瓊脂糖凝膠電泳，Gel ID凝膠圖像分析系統攝片并分析測定其光密度。計算各個樣本mRNA的表達相對值，表達相對值=ERCC1積分光密度/β-actin內對照積分光密度，積分光密度=條帶強度×條帶面積。

1.3.6 免疫組化SP法：SP染色按照試劑盒說明書操作，以3%過氧化氫室溫孵育15 min消除內源性過氧化物酶活性，抗原熱修復，常規IHC標記，DAB染色，蘇木素襯染，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。取已知陽性片在同一條件下染色作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3.7 IHC結果判定：ERCC1、DNMT1陽性主要位于細胞核中，細胞漿可有少量表達，顯微鏡下隨機觀察5個高倍鏡視野(400×)，著色打分：不著色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；褐色為3分。染色細胞所占比例打分：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。兩者相乘，0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為陽性(++)，9～12分為強陽性(+++)，將陰性與弱陽性視為陰性表達，陽性與強陽性視為陽性表達。

1.4 統計學處理應用SPSS 17.0軟件進行統計學處理，計量資料數據組間比較采用t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗，P為雙側性檢驗，P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌組織與癌旁正常組織中ERCC1啟動子區的甲基化情況胃癌組織中ERCC1基因啟動子區甲基化率為68.3%(41/60)，明顯高于癌旁正常組織(23.3%,14/60)，差異有統計學意義(χ2=24.47，P<0.001，見圖1、表1)。

2.2 胃癌組織與癌旁正常組織中ERCC1與DNMT1的mRNA表達情況胃癌組織中ERCC1 mRNA陽性率(31.7%，19/60)顯著低于癌旁正常組織(71.7%，43/60，P<0.05)；而胃癌組織中DNMT1 mRNA陽性率(78.3%，47/60)明顯高于癌旁正常組織(16.7%，10/60，P<0.05)。在ERCC1 mRNA表達下調的胃癌組織中DNMT1 mRNA的表達高于ERCC1 mRNA表達正常的組織，差異有統計學意義(χ2=12.26，P<0.05，見表2)。

A：胃癌組織；B：癌旁正常組織；MP：甲基化陽性對照；M：甲基化條帶；U：非甲基化條帶。

圖1 ERCC1基因MSP產物的電泳圖譜

Fig 1 The electrophoretic pattern of ERCC1 MSP production

表1 胃癌組織的ERCC1蛋白的陽性率和ERCC1基因甲基化[例數(%)]

表2 ERCC1與DNMT1在胃癌組織中表達的相關性

Tab 2 Correlation between ERCC1 and DNMT1 in gastric cancer

ERCC1mRNADNMT1mRNA高表達正常表達χ2值P值低表達36712．26<0．05正常表達711

2.3 胃癌組織與癌旁正常組織ERCC1、DNMT1蛋白表達情況胃癌組織與癌旁正常組織中ERCC1、DNMT1蛋白表達率與mRNA基本一致，ERCC1蛋白在癌旁正常組織中的表達陽性率為93.3%(56/60)，明顯高于胃癌組織(56.7%，34/60)，差異有統計學意義(χ2=21.21，P<0.001)。DNMT1蛋白在胃癌組織中的表達陽性率為71.7%(43/60)，明顯高于癌旁正常組織(16.7%，10/60)，差異有統計學意義(χ2=26.81，P<0.001)。

2.4 胃癌組織中ERCC1基因啟動子區CpG島甲基化狀態與ERCC1 mRNA表達之間的關系在41例ERCC1 mRNA陰性表達的胃癌組織中，檢測出38例(92.7%)該基因啟動子區CpG島甲基化，而在ERCC1 mRNA表達陽性的19例胃癌組織中，僅檢測出3例(15.8%)基因啟動子甲基化，差異有統計學意義(χ2=35.48，P<0.001)。

2.5 胃癌組織中ERCC1與DNMT1蛋白表達之間的相關性分析胃癌組織中的ERCC1與DNMT1蛋白的表達呈負相關(r=-0.669，P<0.001，見圖2)。

圖2 ERCC1積分值與DNMT1積分值相關分析

3 討論

ERCC1基因位于染色體19q13.2，全長15 kb，含10個外顯子，該基因在核苷酸切除修復(NER)途徑中起著重要作用，是NER過程中的先導基因[11]，該基因編碼一種單鏈DNA核酸內切酶，與化學交聯聚乙烯(XPE)形成二聚體，識別損傷切割DNA，使突變的基因得到修復，防止細胞進一步癌變，降低腫瘤的發病風險[12]。

檢測腫瘤抑癌基因的甲基化可以用于癌癥的診斷與治療。目前有相關研究發現，DNA甲基化在一定程度上是可逆的，而DNA甲基化需要DNMT的催化，因此可以應用甲基轉移酶抑制劑阻斷DNA維持甲基化狀態，稱為去甲基化[5]。大量的體外研究證實，應用5-氮雜-2-脫氧胞苷處理后，抑癌基因表達缺失的胃癌細胞株均重新表達該基因，故通過抑癌基因去甲基化可恢復基因的正常功能，為腫瘤的治療提供了一個新的方法[13-14]。

本研究發現：胃癌組織中ERCC1啟動子區的甲基化率較正常組織明顯升高，差異具有統計學意義，推測ERCC1表達的缺失與該基因啟動子的甲基化存在一定的關系，抑癌基因高甲基化可能導致表達的降低或缺失，而DNMT1在甲基化的過程中起著維持甲基化的作用。我們對ERCC1的甲基化與DNMT1的關系進行了初步的研究。本研究結果顯示：DNMT1蛋白在胃癌組織中的表達較正常組織明顯升高，DNMT1與ERCC1蛋白的表達呈負相關，差異具有統計學意義(P<0.05)。綜合以上研究結果，初步推測：胃癌組織中DNMT1的mRNA及蛋白表達顯著增高，導致抑癌基因ERCC1基因啟動子區發生異常甲基化，使抑癌基因mRNA及蛋白表達減少或缺失，失去抑制作用，具體發生機制還有待大樣本實驗進一步研究證實。

目前胃癌仍是世界上最常見的惡性腫瘤之一，外科手術治療是目前的主要手段，但是早期診斷及早期手術是降低胃癌病死率的關鍵。本研究結果有助于進一步完善胃癌發生過程中的表觀遺傳修飾理論，為胃癌的診治提供新的思路，為胃癌的預防、早期診斷及治療提供試驗和理論依據。

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(責任編輯：馬 軍)

Promoter methylation of the ERCC1 genes and DNMT1 expression in gastric cancer

ZHANG Jie, ZHANG Mei, JIANG Xiangjun

Department of Gastroenterology, the Affiliated Qingdao Municipal Hospital of Dalian Medical University, Qingdao 266011, China

Objective To investigate promoter methylation of ERCC1 gene,expression of DNMT1 and the relationship between expression of DNMT1 and gastric cancer.Methods Methylation status of the ERCC1 gene in 60 gastric cancer tissues and 60 normal tissues adjacent to cancer were detected by methylation-specific PCR (MSP). RT-PCR was used to detect the mRNA expressions of ERCC1 and DNMT1, immunohistochemistry (IHC) was employed to detect the protein expressions of ERCC1 and DNMT1 in the above samples.Results The positive rate of promoter methylation of the ERCC1 in gastric cancer was 68.3%, higher than that in normal tissues adjacent to cancer (23.3%,P<0.001).The positive rate of ERCC1 expression in gastric cancer was significantly lower than that in normal tissues adjacent to cancer (31.7%vs71.7%,P<0.05). DNMT1 mRNA expression was higher compared with normal tissues adjacent to cancer(78.3%vs16.7%，P<0.05). Methylation rate of ERCC1 mRNA negative expression in gastric cancer was significantly higher than that of ERCC1 mRNA positive expresion in gastric cancer (92.7%vs15.8%,P<0.001).Conclusion The promoter methylation of the ERCC1 gene and high expression of DNMT1 may be associated with the occurrence of gastric cancer.

Gastric cancer; ERCC1 gene; Methylation; DNMT1

張杰，碩士在讀，研究方向：消化系疾病。E-mail：zj382506550@163.com

姜相君，教授，博士生導師，主任醫師，研究方向：消化系疾病。E-mail：drjxj@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.06.008

R735.2

A

1006-5709(2016)06-0626-04

2015-07-22