基質金屬蛋白酶-11在胃癌組織中的表達及其與臨床病理特征的關系

徐 進，王 斌，陳 珺，劉 穎，汪啟斌，劉涵翰

湖北醫藥學院附屬人民醫院 1.消化內科； 2.胃腸外科； 3.病理科，湖北 十堰 442000

基質金屬蛋白酶-11在胃癌組織中的表達及其與臨床病理特征的關系

徐 進1，王 斌1，陳 珺1，劉 穎1，汪啟斌2，劉涵翰3

湖北醫藥學院附屬人民醫院 1.消化內科； 2.胃腸外科； 3.病理科，湖北 十堰 442000

目的 探討胃癌組織中基質金屬蛋白酶-11(matrix metalloproteinase，MMP-11)在胃癌中的表達，分析其與臨床病理特征之間的關系。方法 采用免疫組織化學(IHC)和RT-PCR方法檢測44例胃癌患者手術標本、癌旁組織標本中MMP-11蛋白及MMP-11 mRNA的表達，分析其與胃癌臨床病理特征之間的關系。結果 MMP-11蛋白在胃癌、癌旁組織中的表達陽性率分別為72.7%、11.4%，差異有統計學意義(P<0.05)。MMP-11 mRNA在癌旁組織與胃癌組織中的表達水平差異有統計學意義(P<0.05)；MMP-11的表達與胃癌患者性別、年齡、病變部位及病變長度無相關性(P>0.05)，而與胃癌浸潤深度、分化程度及淋巴結轉移具有相關性(P<0.05)。結論 MMP-11在胃癌組織中的表達均隨著胃癌進展而增強，提示MMP-11對胃癌的發生和轉移有促進作用。

胃癌；基質金屬蛋白酶-11；免疫組織化學；反轉錄聚合酶鏈反應；預后

侵襲、轉移是胃癌惡性生物學行為重要的特征，是多步驟、多因素參與的復雜過程，也是造成胃癌患者預后差的最主要原因[1-2]。研究[3]表明，基質金屬蛋白酶(matrix metallo-proteinase，MMP)是一組結構相近、功能復雜的蛋白水解酶，可有效降解細胞外幾乎所有基質成分，破壞細胞外基質，促使癌細胞對周圍正常組織浸潤，導致腫瘤的擴散和轉移。我們通過檢測胃癌組織與相應的癌旁組織中MMP-11蛋白表達，同時檢測MMP-11 mRNA的表達，探討其在胃癌浸潤、轉移中的作用及相互關系，對闡明胃癌侵襲轉移機理、評估轉移的情況和判斷預后具有一定的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 標本來源標本來自2013年1-2014年7月湖北醫藥學院附屬人民醫院胃腸外科住院的胃癌患者，所有患者術前均未行放射和化學治療，全部病例均行手術治療，留取胃癌組織手術標本，由病理科醫師在腫瘤生長良好、無壞死區域的胃癌手術切除標本取材2塊，同時在距離腫瘤5 cm遠的黏膜組織取材2塊，作為對照組。所有標本均分為2份，一份立即固定于4%多聚甲醛溶液中，常規石蠟包埋，切片厚度5 μm，用于免疫組織化學檢測；另一份保存于液氮中行RT-PCR檢測。

1.2 臨床資料收集湖北醫藥學院附屬人民醫院胃腸外科胃癌手術患者44例，男26例，女18例，年齡36～71歲，中位年齡56歲；病變長度≤5 cm者21例，>5 cm者23例；依據WHO胃癌組織分型標準，高、中分化15例，低分化29例；根據國際抗癌聯盟(UICC)標準，胃癌患者中T1期20例，T2～T4期24例；無淋巴結轉移23例，有淋巴結轉移21例。腫瘤位于胃竇者19例，胃體者16例，賁門者9例。

1.3 主要試劑鼠抗人MMP-11單克隆抗體、β-actin鼠抗人單克隆抗體及即用型免疫組化染色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術公司；Trizol試劑、RT-PCR試劑盒、Taq酶(TaKaRa公司)；引物序列(Invitrogen公司合成)。

1.4 免疫組織化學SP法測定MMP-11蛋白的表達主要步驟：將4 μm石蠟切片脫蠟至水，以3%H2O2處理10 min阻斷內源性過氧化物酶，微波修復10 min，以10%山羊血清室溫封閉20 min，加MMP-11單克隆抗體(1∶100)，4 ℃濕盒中過夜，滴加二抗、三抗，室溫濕盒內孵育20 min，二氨基聯苯胺顯色，蘇木精復染，常規脫水，封固。嚴格按試劑盒說明書操作。采用雙盲法，全部切片由2位高年資病理科醫師鏡下觀察并診斷，獨立觀察每張切片5個具有代表性的高倍視野，組織切片中胞質或胞核染為淡黃色至棕黃色為陽性細胞標志，采用半定量積分法[4]，根據腫瘤細胞質或核的染色程度及染色細胞百分率進行分析評分：基本不著色為0分，著色淡者為1分，適中為2分，深者3分；著色細胞占計數細胞百分率≤5%為0分，6%～30%為1分，31%～60%為2分，≥61%為3分，將每張切片著色程度得分與著色細胞百分率得分相乘為其最后得分，0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～6分為中等陽性(++)，6分以上為強陽性(+++)。

1.5 RT-PCR法測定MMP-11 mRNA表達嚴格按照按Trizol試劑說明書操作進行提取總RNA，紫外分光光度計測定RNA含量及純度。MMP-11上游引物5′-GGATGACCAGGGCACAGA-3′，下游引物5′-TGAGCACCTTGGAAGAACC-3′，產物長度為477 bp；β-actin上游引物5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′，下游引物5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′，產物長度為268 bp。參照反轉錄試劑盒說明書合成cDNA，PCR循環條件：預變性94 ℃ 3 min，變性94 ℃ 1 min；MMP-11退火溫度為55 ℃，β-actin退火溫度為68 ℃；延伸72 ℃ 30 s；32個循環，末次延伸7 min。擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，在紫外燈下觀察電泳結果，結合Syngene凝膠成像分析系統和Multi Gauge V3.1軟件進行吸光度(A)值分析。

1.6 統計學處理采用SPSS 13.0軟件包進行統計分析，免疫組織化學染色(IHC)結果分析采用χ2檢驗，兩組間RT-PCR結果分析采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MMP-11蛋白及mRNA的表達MMP-11蛋白陽性表達細胞的胞質被染成淺黃色、棕黃色或黃褐色。在胃癌組織中MMP-11陽性細胞呈散在片狀或巢狀分布，還可見靠近癌間質中也有表達。MMP-11蛋白在胃癌組織中陽性率為72.7%(32/44)，在癌旁組織中陽性率為11.4%(5/44)，差異有統計學意義(χ2=33.977，P=0.000)。MMP-11 mRNA的擴增產物條帶多為陽性或強陽性，在癌旁組織中多為陰性或弱陽性表達。MMP-11 mRNA在癌旁組織與胃癌組織中的表達水平差異有統計學意義(0.238±0.033vs0.484±0.041，P<0.05，見圖1～3)。

圖1 MMP-11蛋白在胃癌中的表達(400×)； 圖 2 MMP-11 蛋白在癌旁組織中的表達(400×) ；

注：1:胃癌組織；2:癌旁組織；3:標志物。

Fig 3 The expression of MMP-11 mRNA in gastric carcinoma and adjacent tissues

2.2 MMP-11蛋白和mRNA的表達與胃癌臨床病理特征之間的關系MMP-11蛋白和mRNA的表達與胃癌浸潤深度、淋巴結轉移情況及分化程度具有相關性(P<0.05)，與年齡、性別、病變長度、病變部位均無相關性(P>0.05，見表1)。

3 討論

浸潤和轉移是惡性腫瘤的主要生物學特征，也是惡性腫瘤患者死亡的主要原因。MMP是一組鋅離子依賴性蛋白水解酶超家族，研究[5]表明MMPs通過降解細胞外基質在胃癌的浸潤與轉移中起重要作用。MMP-11是MMPs家族成員，又稱基質分解素-3(strome-

表1 MMP-11蛋白及MMP-11 mRNA表達與胃癌臨床病理特征的關系

lysin-3，ST-3),其表達與腫瘤發生以及各種組織重塑有密切關系，與多種腫瘤如胰腺癌[6]、口腔癌[7]、食管癌[8]中均有較強的表達，并認為與腫瘤的發生、發展和預后不良相關[9]。本研究發現，MMP-11蛋白和MMP-11 mRNA的表達在胃癌組織中的表達強度明顯增強，明顯高于癌旁組織，提示MMP-11參與胃癌的發生過程。同時，本文分析MMP-11的表達與胃癌臨床病理特征的關系顯示，其與患者的年齡、性別、腫瘤大小等無明顯相關性，但與腫瘤的浸潤程度、淋巴結轉移及分化程度具有相關性，提示MMP-11在腫瘤的浸潤、轉移方面起到重要作用，提示MMP-11參與胃癌的進展過程，可能是胃癌的不良預后指標。

本研究表明，MMP-11與腫瘤的發生、浸潤、轉移可能有密切關系，有望成為臨床上新的腫瘤標志物，監測MMP-11可作為判斷胃癌生物學行為和預后的重要指標，為腫瘤的早期診斷和治療提供實驗依據。但由于本研究納入病例數少，而且胃癌本身是一個多因素、多環節的疾病，MMP-11具體參與了哪些環節及其機制如何，仍需進一步研究。

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(責任編輯：馬 軍)

The expression of matrix metalloproteinase-11 in gastric cancer and the relationship with clinicopathological features of gastric carcinoma

XU Jin1, WANG Bin1, CHEN Jun1, LIU Ying1, WANG Qibin2, LIU Hanhan3

1. Department of Gastroenterology; 2. Department of Gastrointestinal Surgery; 3. Department of Pathology, Renmin Hospital, Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, China

Objective To investigate the expression of matrix metalloproteinase-11 (MMP-11) in human gastric carcinoma and the correlation with clinicopathological features. Methods The expression of MMP-11 protein in 44 gastric carcinoma surgical specimens and paracancerous tissues was detected by immunohistochemistry (IHC), and the expression of MMP-11 mRNA was detected by reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). The correlation with clinicopathological features of gastric cancer was analyzed. Results The positive rates of MMP-11 expression were 72.7%and 11.4%in gastric carcinoma and paracancerous tissues (P<0.05).The expression of MMP-11 mRNA in gastric carcinoma was significantly higher than that in paracancerous tissues (P<0.05). The expression of MMP-11 was not associated with sex， age， location and size of gastric cancer (P>0.05), but correlated with the depth of invasion， the degree of differentiation of gastric cancer and lymph node metastasis (P<0.05). Conclusion The expression of MMP-11 increased along with the progression of gastric carcinoma. MMP-11 may have auxo-action in development and transferation of gastric carcinoma．

Gastric carcinoma; Matrix metalloproteinase-11; Immunohistochemistry; Reverse transcriptase polymerase chain reaction; Prognosis

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.06.009

徐進，碩士，主治醫師，研究方向：胃腸道疾病的臨床與基礎研究。E-mail：xujin200725@126.com

王斌，博士，主任醫師，研究方向：胃腸道疾病的臨床與基礎研究。E-mail：wang-bqh@126.com

R735.2

A

1006-5709(2016)06-0630-03

2015-07-22