三葉青水提取物對NK細胞殺傷胃癌BGC-823細胞的影響

袁 雨，朱炳喜，劉軍權，周 燏，呂小婷，周忠海，陳永強，楊 陽

1. 徐州醫科大學，江蘇 徐州 221002； 2. 中國人民解放軍第九七醫院

三葉青水提取物對NK細胞殺傷胃癌BGC-823細胞的影響

袁 雨1，朱炳喜1，劉軍權2，周 燏2，呂小婷2，周忠海2，陳永強2，楊 陽2

1. 徐州醫科大學，江蘇 徐州 221002； 2. 中國人民解放軍第九七醫院

目的 探討三葉青水提取物對人NK細胞殺傷胃癌BGC-823細胞的影響及機制。方法 采用干細胞生長培養基(SCGM)體外擴增人外周血NK細胞，不同濃度三葉青水提取物作用于NK細胞后，采用CCK8法檢測三葉青水提取物對NK細胞增殖率的影響，流式細胞術(FCM)檢測NK細胞穿孔素(PFP)、顆粒酶B(GraB)及CD107a的表達，乳酸脫氫酶(LDH)釋放法檢測NK細胞對胃癌BGC-823細胞的殺傷活性。結果 三葉青水提取物作用人NK細胞48 h后，三葉青水提取物0.0003～78.125 μg/ml 濃度組的NK細胞增殖明顯(P<0.05)；三葉青水提取物0.305～4.883 μg/ml濃度組人NK細胞PFP、GraB及CD107a表達高于對照組(P<0.05)；三葉青水提取物0.305～19.531 μg/ml 濃度組人NK細胞對胃癌BGC-823細胞殺傷活性較對照組增強，差異有統計學意義(P<0.05)。結論 三葉青水提取物能促進NK細胞的增殖，能增強NK細胞對胃癌BGC-823細胞的殺傷活性，這可能與三葉青水提取物上調NK細胞PFP、GraB及CD107a表達有關。

三葉青；NK細胞；胃癌BGC-823細胞；殺傷活性

三葉青(Tetrastigma hemsleyani)為葡萄科崖爬藤屬植物三葉崖爬藤，主要分布于我國西南及安徽、浙江、江西等地[1]。作用于機體后可發揮清熱解毒、活血止痛、祛風化痰、調節免疫等作用，現在臨床上多采用三葉青治療哮喘、肺炎、肝炎、風濕、咽痛、瘰疬等疾病，且具有很好的療效[2]。近幾年來， 三葉青的抗腫瘤作用成為研究熱點，許多文獻[3-4]報道三葉青提取物在體外具有抑制腫瘤細胞增殖及誘導其凋亡的作用。自然殺傷細胞(natural killer cells,NK)是人體固有免疫的主要淋巴細胞之一，無需事先致敏和免疫即可識別腫瘤及病毒感染細胞，發揮細胞毒性無主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)限制性[5]。NK細胞殺傷腫瘤細胞主要是通過Fas和FasL相互作用后釋放顆粒酶B(Granzyme B，GraB)和穿孔素(perforin，PFP)來實現[6]。本實驗主要研究三葉青水提取物在體外作用于人NK細胞后對人NK細胞殺傷胃癌BGC-823細胞的影響及其可能的機制，為將來深入研究三葉青的抗腫瘤機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料三葉青塊莖(浙江漢邦生物科技有限公司)；人胃癌細胞株BGC-823(中國科學院上海細胞研究所)；二甲亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)(Sigma公司)；人AB血漿(徐州市血站)；淋巴細胞分離液(中國科學院血液病研究所)；RPMI 1640培養基、胰蛋白酶、胎牛血清(Gibco公司)；PE標記的CD3、FITC標記的CD56(美國BD公司)；PE標記的GraB (Granzyme B, GraB)、穿孔素(Perforin, PFP)(Ebioscience公司)；乳酸脫氫酶試劑盒、APC標記的CD107a(美國BD公司)；CCK8試劑(碧云天生物技術研究所)。

1.2 主要儀器恒溫CO2培養箱(德國Heraeus公司)；倒置顯微鏡(德國Wilovert公司)；超凈工作臺(蘇州凈化設備廠)；低溫高速離心機(德國Eppendorf公司)；流式細胞檢測儀(美國BD公司)；SEAC全自動酶免系列分析儀(北京西亞克技術有限公司)。

1.3 三葉青水提取物制備由解放軍第九七醫院藥劑科楊陽[7]進行提取，取三葉青干燥藥材200 g，加5倍體積80%乙醇水溶液浸泡24 h后，加熱回流提取，共3次，每次40 min，合并提取液，過濾，減壓回收蒸干，得總提取物。取總提取，加水混懸，分別采用10倍體積的石油醚、乙酸乙酯等進行分步萃取。將上述經有機溶劑提取后的三葉青藥材水煮后減壓回收蒸干，獲得三葉青水提取物。

1.4 NK細胞培養及表型鑒定取健康成年志愿者外周靜脈血20 ml，低分子肝素鈉抗凝后加入淋巴細胞分離液，離心2 000 r/min×13 min(離心半徑為10 cm)。玻璃吸管吸取單個核細胞層，PBS洗滌2次，將細胞加入含有rhIL-2 和人AB血漿的SCGM培養基中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。收集培養10 d的NK細胞，PBS洗滌后將細胞濃度調整為1×106/ml。在細胞懸液中加入FITC-Anti-CD56和PE-Anti-CD3，室溫下避光孵育15 min，PBS洗滌并重懸細胞，采用流式細胞術檢測NK細胞表型。

1.5 胃癌細胞株BGC-823的培養取復蘇后的胃癌BGC-823細胞加入細胞培養瓶，隨后加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液15 ml，于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養。每天觀察細胞生長情況，根據細胞生長情況進行換液。待細胞鋪滿瓶底時，用2.5 g/L胰蛋白酶消化細胞使其脫壁，收集細胞后離心800 r/min×3 min，棄去上清，使用生理鹽水反復吹打混勻細胞，計數后用于實驗。

1.6 CCK8法檢測三葉青水提取物對人NK細胞增殖的影響取培養10 d的NK細胞，將其配制成1×105/ml，以180 μl/孔的劑量接種于96孔板。設置對照組和實驗組，對照組不加三葉青水提取物，實驗組加入三葉青水提取物(終濃度分別為0.0003、0.0012、0.0048、0.019、0.076、0.305、1.221、4.883、19.531、78.125、312.5、1250 μg/ml)，每組設3個復孔，將96孔板放入 37 ℃、5% CO2培養箱中繼續培養NK細胞24 h、48 h、72 h，隨后在每孔中加入CCK8 20 μl，繼續培養4 h后棄去上清。將酶標儀測定波長調為450 nm，檢測96孔板各孔吸光度(OD)值，根據公式計算細胞增殖率(%)，每組實驗重復3次，取平均值。增殖率(%)=(實驗組OD值-對照組OD值)/對照組OD值×100%。

1.7 流式細胞術檢測三葉青水提取物作用48 h后NK細胞PFP、GraB、CD107a的表達NK細胞培養10 d后，將其鋪入6孔板，3 ml/孔。設置對照組和實驗組，對照組不加三葉青水提取物，實驗組加入不同濃度三葉青水提取物(終濃度分別為0.076、0.305、1.221、4.883、19.531 μg/ml)，用PBS洗滌3次后將細胞數調至1×106/ml。每管加入FITC-Anti-CD56和PE-Anti-CD3各20 μl，GraB和PFP組均加入固定劑100 μl及破膜劑100 μl，隨后分別加入anti-GraB-PE、anti-PFP-PE各5 μl。CD107a組不加入破膜劑，僅加入anti-CD107a-APC，三組均設置同型對照抗體管，孵育、洗滌后采用流式細胞檢測儀檢測NK細胞GraB、PFP及CD107a的表達，每組實驗重復3次，取平均值。

1.8 LDH釋放法檢測三葉青水提取物作用48 h后NK細胞對胃癌BGC-823細胞的殺傷活性取培養10 d的NK細胞鋪入6孔板，3 ml/孔。對照組不加三葉青水提取物，實驗組加入不同濃度的三葉青水提取物(終濃度分別為0.076、0.305、1.221、4.883、19.531 μg/ml)，繼續培養48 h，收集NK細胞作為效應細胞，胃癌BGC-823細胞作為靶細胞，將效應細胞和靶細胞分別配成2×106/ml和2×105/ml的細胞懸液，效靶細胞等體積混合(效靶細胞數比例為10∶1)。將混合后的效靶細胞置于37 ℃、5% CO2培養箱中孵育6 h后，離心1 500 r/min×10 min，取上清液。按LDH試劑說明書要求操作，340 nm波長下全自動生化分析儀測定吸光度值(A)，每檢測樣本設3個復管，實驗重復3遍。NK細胞的殺傷活性(%)=(A實驗組-A效應細胞自然釋放組)/(A靶細胞最大釋放組-A靶細胞自然釋放組)× 100%。

2 結果

2.1 人NK細胞的培養及鑒定NK細胞培養結果顯示，人NK細胞在體外擴增培養10d后，可見大的集落和散在的細胞生長，單個細胞呈橢圓形或梭形生長。 流式細胞術檢測結果顯示，PBMC未培養前NK細胞(CD3-CD56+)比例為6.12%，培養10d后NK細胞比例增加到81.33%(見圖1)。

圖1 培養10 d的NK細胞倒置顯微鏡照片(400×)

Fig1InvertedmicroscopephotoofNKcellsculturedafter10days(400×)

2.2 CCK8法檢測不同濃度三葉青水提取物對NK細胞增殖的影響三葉青水提取物作用于NK細胞24h、48h和72h后，三葉青水提取物0.0012～78.125μg/ml濃度組的NK細胞增殖率均較對照組升高(P<0.05)。三葉青水提取物作用24h和48h后1 250μg/ml組和72h后312.5～1 250μg/ml組對NK細胞生長有抑制作用(P<0.05)。相同濃度的三葉青水提取物作用于NK細胞后(0.076～78.125μg/ml濃度組)，48h組NK細胞增殖率與24h、72h組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；作用48h時，三葉青水提取物濃度為1.221μg/ml時細胞增殖率為(41.75±2.64)%，達到最高值(見圖2)。

注：與對照組比較，*P<0.05；濃度相同時，與其他時間組比較，△P<0.05。

圖2 不同濃度三葉青水提取物對NK細胞增殖率的影響

Fig2EffectofdifferentconcentrationsofwaterextractofTetrastigmahemsleyaniontheproliferationrateofNKcells

2.3 三葉青水提取物對NK細胞PFP、GraB、CD107a表達的影響三葉青水提取物作用于NK細胞48h后，NK細胞PFP、GraB和CD107a的表達均有升高，0.305～4.883μg/ml濃度組與對照組比較，差異均有統計學意義(P< 0.05)；且當三葉青水提取物濃度為1.221μg/ml時，GraB、PFP和CD107a的表達率均達到最大值；濃度>1.221μg/ml時，三者的表達率開始下降(見表1、圖3)。

三葉青水提取物(μg/ml)PFPGraBCD107a0(對照組)72．89±2．0853．69±3．5583．76±3．760．07676．16±3．1256．68±2．1388．01±1．860．30582．58±3．84?62．47±2．60?90．45±2．63?1．22190．17±2．14?69．19±1．33?93．91±2．08?4．88383．81±4．47?67．44±2．04?90．68±3．26?19．53180．61±2．73?60．56±3．05?84．10±2．47

注：與對照組相比，*P<0.05。

注： A1～3：同型對照組； B1～3：對照組； C1～3：實驗組。

2.4 三葉青水提取物對NK細胞殺傷胃癌BGC-823細胞的影響濃度為0.305～19.531 μg/ml的三葉青水提取物作用NK細胞48 h后，NK細胞對胃癌BGC-823細胞的殺傷活性較對照組增強(P<0.05)；且濃度為1.221 μg/ml時，NK細胞對胃癌BGC-823細胞的殺傷活性達到最大[(67.75± 2.58)%,見圖4]。

注：與對照組比較，*P< 0.05。

3 討論

近年來，從天然中藥中尋找活性成分成為抗腫瘤藥物發展的重點之一。三葉青為我國特有珍稀植物，研究[8-9]發現三葉青多種提取成分在體外可抑制腫瘤細胞的生長。丁麗等[10-11]發現三葉青水提取物對胃癌、宮頸癌及惡性黑色素瘤有較強抑制作用。然而，三葉青水提取物對體外誘導培養的NK 細胞的增殖作用及其免疫學影響尚未見報道。本實驗結果表明，三葉青水提取物作用于NK細胞24 h、48 h和72 h后，三葉青水提取物濃度為0.0012～78.125 μg/ml時可促進NK細胞的增殖，濃度為0.0012～1.221 μg/ml時，三葉青水提取物促進NK細胞增殖呈上升趨勢，濃度為1.221 μg/ml時，NK細胞增殖率達峰值，1.221～78.125 μg/ml時三葉青水提取物促進NK細胞增殖呈下降趨勢，由此說明三葉青水提取物對NK細胞具有雙向調節作用，在適宜的濃度下可促進NK細胞增殖，提示三葉青水提取物對NK 細胞的增殖具有一定程度的促進作用，這可能對提高體外培養 NK 細胞的數量用于腫瘤的免疫治療提供了實驗依據。

NK 細胞是固有免疫應答中最主要的效應細胞群，其兩大主要功能是識別與溶解腫瘤細胞和病毒感染細胞及產生免疫調節性細胞因子[12]。NK細胞功能低下或缺陷的患者易發感染，且腫瘤的發生率和轉移率提高[13]。彭六生等[14]研究發現胃癌患者腫瘤組織內NK細胞的百分率與胃癌的進展密切相關,且高于NK細胞百分率中位數的患者總體存活時間較長。本實驗發現，0.305～19.531 μg/ml的三葉青水提取物作用于NK細胞后能提高NK細胞對胃癌BGC-823細胞的殺傷作用，且NK細胞殺傷活性增高趨勢與三葉青水提取物作用于NK細胞后NK細胞增殖增長趨勢一致，由此提示，三葉青水提取物可能通過促進NK細胞的增殖進而增強對胃癌BGC-823細胞的抑制。

穿孔素和顆粒酶被認為是存在于細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)和NK細胞中的具有細胞毒性的物質。GraB以酶原的形式合成加工后儲存在細胞質顆粒內，細胞質顆粒內的酸性環境可保持GraB處于非活性狀態，從而保障細胞不被自身顆粒酶溶解，然而當與靶細胞接觸后，穿孔素可從這些細胞中釋放出來，在靶細胞膜上形成穿孔素管道，GraB N-端的酸性二肽被切除成為活性型GraB，通過靶細胞膜上的多聚穿孔素通道進入靶細胞從而殺傷靶細胞[15]。因此，穿孔素和顆粒酶被認為是可以反映NK細胞功能活性的可靠指標。此外， CD107a分子隨著細胞脫顆粒到達細胞膜表面，且其表達程度與穿孔素的分泌多少一致。因此，NK細胞表達CD107a分子也可代表其具有殺傷活性[16]。本實驗發現，0.305～4.883 μg/ml濃度組三葉青水提取物作用于NK細胞48 h后，與對照組相比，PFP、GraB、CD107a的表達均有不同程度的增加，差異有統計學意義，且在三葉青水提取物濃度為1.221 μg/ml時，PFP、GraB、CD107a表達均達最高。這與三葉青水提取物作用后NK細胞對胃癌BGC-823細胞殺傷活性的峰值一致，表明三葉青水提取物增強NK細胞對胃癌BGC-823細胞的殺傷活性，我們猜測這可能與三葉青水提取物上調PFP、GraB、CD107a的表達有關。

綜上所述，三葉青水提取物不僅能夠促進NK細胞的增殖，而且可以增強其殺傷胃癌細胞的能力，我們推測這可能與三葉青水提取物促進NK細胞PFP、GraB及CD107a的表達有關，可為三葉青用于胃癌的免疫治療提供一定的實驗依據。

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(責任編輯：馬 軍)

Effect of the water extract of Tetrastigma hemsleyani on the cytotoxic activity of NK cells against gastric cancer cell lines BGC-823

YUAN Yu1, ZHU Bingxi1, LIU Junquan2, ZHOU Yu2, LV Xiaoting2, ZHOU Zhonghai2, CHEN Yongqiang2, YANG Yang2

1. Xuzhou Medical University, Xuzhou 221002; 2. The 97th Hospital of Chinese PLA, China

Objective To explore the effect and mechanism of the water extract of Tetrastigma hemsleyani on the cytotoxic activity of NK cells against gastric cancer cell lines BGC-823.Methods The amplification of human NK cells was induced by stem cell growth medium (SCGM) in vitro. NK cells with different concentrations of water extract of Tetrastigma hemsleyani in vitro were cultured. CCK8 assay was used to measure the growth curve of NK cells. The expressions of perforin (PFP), Granzyme B (GraB) and CD107a on NK cells were detected by flow cytometry (FCM). The cytotoxic activity of NK cells to gatric cancer BGC-823 cells was detected by lactate dehydrogenase (LDH) release.Results With the water extract of Tetrastigma hemsleyani after 48 hours, the proliferation rate of human NK cells was increased significantly with the water extract of Tetrastigma hemsleyani at concentrations from 0.0003 to 78.125 μg/ml (P<0.05); the expressions of GraB, PFP and CD107a of human NK cells with the water etract of Tetrastigma hemsleyani at concentrations from 0.305 to 4.883 μg/ml were significantly higher than control group (P<0.05); the cytotoxic activity of human NK cells against BGC-823 with the water extract of Tetrastigma hemsleyani at concentrations from 0.305 to 19.531 μg/ml was remarkably higher than the control group (P<0.05). Conclusion The water extract of Tetrastigma hemsleyani at a certain range of concentrations could promote the proliferation of NK cells and enhance the cytotoxic activity of NK cells to BGC-823 cells. The possible mechanism may be that the water extract of Tetrastigma hemsleyani could increase expressions of PFP, GraB and CD107a.

Tetrastigma hemsleyani; NK cells; Gastric cancer cell lines BGC-823; Cytotoxic activity

袁雨，碩士研究生，研究方向：消化道腫瘤的基礎與臨床。E-mail: 779192313@qq.com

朱炳喜，主任醫師，副教授，研究方向：消化道腫瘤的基礎與臨床。E-mail: 82200496@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.06.010

R735.2

A

1006-5709(2016)06-0633-05

2015-10-20