FTO在非酒精性脂肪性肝病患者肝組織中的表達及意義

吳 雪， 馬圓圓， 劉曉鋼， 李 珊， 張麗俠， 鄭麗麗

1.鄭州大學第一附屬醫院內分泌科, 河南 鄭州450052; 2.河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室

FTO在非酒精性脂肪性肝病患者肝組織中的表達及意義

吳 雪1,2， 馬圓圓1， 劉曉鋼1， 李 珊1， 張麗俠1， 鄭麗麗1

1.鄭州大學第一附屬醫院內分泌科, 河南 鄭州450052; 2.河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室

目的 研究非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)患者肝穿刺組織中脂肪量與肥胖相關基因(fat mass and obesity associated gene, FTO)的表達，探索FTO在NAFLD發生、發展中的作用。方法 免疫組化SP二步法檢測肝穿刺組織中FTO蛋白表達，并回顧性分析臨床生化指標及肥胖、胰島素抵抗等相關參數。結果 正常對照組、非酒精性單純性脂肪肝(nonalcoholic simple fatty liver, NAFL)組、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)組均有FTO蛋白表達。與正常對照組相比，NAFL和NASH組中FTO蛋白明顯升高，差異有顯著統計學意義(P<0.001)；且NASH和NAFL組糖、脂代謝及肥胖參數等與正常對照組比較，差異有統計學意義(P<0.01)。結論 FTO可能通過干擾機體糖、脂代謝、增加胰島素抵抗參與NAFLD的發生、發展。

肥胖相關基因；肥胖；非酒精性脂肪性肝病

近年來，隨著我國國民經濟的快速發展，人民的飲食結構及生活方式也隨之發生了非常大的改變，肥胖人群數量迅速增多，而在肥胖人群中，非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)的發病率高達75%，初步估計在全球范圍內NAFLD人群所占比例可能達到15%～30%[1]。脂肪量與肥胖相關基因(fat mass and desity associated gene,FTO)是近年來第一個被明確與肥胖有極為密切關系的新候選基因[2]。大量研究結果顯示FTO與代謝綜合征、2型糖尿病、冠心病等多種代謝性疾病相關，是其發病及造成相關死亡的獨立危險因素之一[3-7]。而有關FTO與NAFLD的關系及其作用機制的研究相對較少，FTO在NAFLD患者肝臟中如何分布，表達多少及FTO與NAFLD是否相關，目前尚不甚明確。本研究通過免疫組化檢測NAFLD患者肝穿刺組織中FTO的表達，同時RT-PCR測定人肝L02細胞肝細胞脂肪變性模型的FTO mRNA表達水平，探討FTO在NAFLD發生、發展中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2010年1月-2014年12月在鄭州大學第一附屬醫院消化內科住院治療并行B超引導下經皮肝穿刺的患者,回顧性分析其臨床與病理資料。經影像及組織病理學診斷為NAFLD [均符合中華醫學會肝臟病學分會制定的NAFLD診斷及排除標準(2010年版)[8]]的患者，根據NAFLD活動度積分(NAFLD activity score, NAS)將其分為非酒精性單純性脂肪肝組(nonalcoholic simple fatty liver, NAFL)和非酒精性脂肪性肝炎組(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)；無脂肪變性和脂肪性肝炎的其他肝病病例作為對照組。NAFLD組與對照組均排除可引起脂肪肝的藥物、疾病等[8]。B超引導下經皮肝穿刺由我院臨床醫師操作完成，標本固定、石蠟包埋、切片及診斷由我院病理科醫師完成。

1.2 研究方法

1.2.1 參數記錄：回顧性查閱患者病歷，記錄研究對象的一般資料：年齡、性別、身高、體質量、腰圍、臀圍，并計算體質量指數[BMI=體質量(Kg) /身高2(m2)]、腰臀比[WHR=腰圍(cm) /臀圍(cm)]。血清學指標：甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、γ谷酰胺轉肽酶(GGT)、堿性磷酸酶(ALP)、C反應蛋白(CRP)，并計算穩態模式胰島素抵抗指數[HOMA-IR=FBG×FINS/22.5]、胰島素敏感性指數[ISI=1/FBG×FINS]。

1.2.2 FTO蛋白檢測：免疫組化SP二步法檢測肝穿刺組織中FTO蛋白表達。一抗為兔抗人FTO多克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司)，稀釋度為1∶300；二抗S-P免疫組化試劑盒、DAB顯色液盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)；相關操作嚴格按照說明書進行。以PBS代替一抗作為陰性對照。染色后每張切片隨機選擇5個視野，以同樣的顯微鏡環境與拍攝條件拍攝照片，采用ImagePro-Plus 6.0專業圖像分析軟件，測定肝臟FTO染色陽性的累積光密度值(IOD)，取其平均數作為每張切片上FTO蛋白的表達量。

2 結果

2.1 一般資料及血清學指標的比較 正常對照組與NAFL組、NASH組的性別、年齡構成比差異無統計學意義 (P>0.05),具有可比性；與正常對照組相比，NAFL、NASH組患者BMI、WHR、FINS、TG、ALT、AST、GGT、CRP、FTO水平及HOMA-IR顯著升高，HDL、ISI降低(P<0.001)；與正常對照組相比，NASH組HbA1c、ALP、LDL、TC升高(P<0.05)；與NAFL組相比，NASH組HDL降低(P<0.05)，LDL、ALT、AST、GGT、BMI升高(P<0.05)，FPG、FIns、HOMA-IR、TG、TC顯著升高(P<0.01，見表1)。

正常對照組NAFL組NASH組年齡(歲)37．5±9．238．5±10．337．3±13．8例數(男/女)20(15/5)56(34/22)75(46/29)FTO蛋白7280．20±4149．2523053．24±9901．35b23191．17±14557．71bBMI(kg/m2)21．59±1．6226．09±2．12b27．83±2．28bcWHR0．84±0．020．92±0．05b0．94±0．06bFPG(mmol/L)4．68±0．404．69±0．605．27±0．44bdFINS(mU/L)5．47±0．617．78±2．16b11．49±4．98bdHbA1c(%)4．79±0．325．07±．445．15±0．39aHOMA?IR1．14±0．211．63±0．54b2．71±1．29bdISI0．040±0．0060．030±0．009b0．019±0．006bdTG(mmol/L)1．10±0．411．83±0．60b2．57±0．54bdTC(mmol/L)4．08±0．844．41±0．735．20±0．97adHDL(mmol/L)1．24±0．290．94±0．20b0．79±0．12bcLDL(mmol/L)2．46±0．742．68±0．393．26±0．84acALT(U/L)20．30±10．1879．06±35．57b112．94±48．57b，cAST(U/L)19．15±7．59 47．59±29．31b63．44±27．65bcGGT(U/L)19．15±10．7755．65±24．42b85．89±41．95bcALP(U/L)74．85±16．8781．82±25．1794．44±32．72aCRP(mg/L)0．41±0．301．79±1．76b3．54±5．47b

注：與正常對照組比較，aP<0.05，bP<0.001；與NAFL組比較cP<0.05，dP<0.01。

2.2 FTO蛋白表達、組織學定位及其相關關系分析 免疫組化染色結果可見FTO蛋白普遍表達于肝臟，組織學定位主要在肝細胞胞質，少見于細胞核(見圖1) ；與正常對照組相比，NAFL及NASH組FTO蛋白陽性表達的累積光密度IOD值明顯升高(見表1、圖1B～1D)，差異有顯著統計學意義(P<0.001)；隨著肝臟脂肪變程度的加重[8]，FTO蛋白表達量有升高的趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05，見圖2)。

圖1 FTO在不同組間的表達情況(免疫組化400×) A: PBS代替一抗; B: 正常對照組; C: NAFL組; D: NASH組

Fig 1 The expression of FTO in different groups (Immunohistochemistry 400×) A: PBS instead of primary antibody; B: normal control group; C: NAFL group; D: NASH group

注：與正常對照組相比, #P<0.001，模型組間相比, *P>0.05。

圖2 FTO蛋白在不同組間的表達

Fig 2 The expression of FTO in different groups

3 討論

作為一種與遺傳-環境-代謝應激等多種因素相關的疾病，NAFLD與肥胖關系極為密切。環境因素及個體生活行為方式對肥胖的發生有重要影響，而遺傳易感性則增加肥胖的發病危險及嚴重程度[9]。FTO是近年來第一個被明確與肥胖有密切關系的新型候選基因[2]。FTO定位于人類第16條染色體長臂(16q12.2)，該基因片段全長約400 kb,共包含有9個外顯子；FTO基因在不同年齡、不同性別人群的多種組織中廣泛表達，尤其在下丘腦、垂體、腎上腺等部位高度表達[2]，提示其與能量代謝有一定關系。

目前，FTO與肥胖、NAFLD的關系及其作用機制越來越受到人們的重視。在對不同地域多個人種的獨立研究中證實FTO基因的單核苷酸多態性(SNPs)可影響成人及兒童的BMI，增加體質量、體內脂肪量，改變攝食行為等[2]。有研究顯示FTO與1型糖尿病無相關性，但是與2型糖尿病存在顯著相關性[12]，間接提示FTO與胰島素抵抗及NAFLD有著緊密聯系。Bravard等[11-12]在研究中證實過表達FTO可顯著增加脂肪細胞內脂質沉積并引起細胞內活性氧族(ROS)聚集。Guo等[13]在NAFLD大鼠模型中發現其肝組織FTO mRNA及蛋白的表達水平明顯升高，并且標志氧化應激水平的丙二醛(MDA)水平升高和抗氧化能力的超氧化物歧化酶(SOD)水平降低；體外細胞實驗同樣顯示在L02肝細胞系中通過質粒轉染過表達FTO基因會增加氧化應激并造成肝細胞內脂質沉積。Zhang等[14]進一步證實FTO在NAFLD大鼠肝臟中與叉頭轉錄因子FoxO1表達趨勢一致，提示二者具有相關性，發揮協同作用導致NAFLD。

本課題組前期研究發現在NAFLD大鼠肝臟中FTO基因表達增加，且在高脂孵育不同時間長度(24 h、48 h、72 h)的人L02肝細胞中FTO mRNA的表達水平也明顯增加[14]。但FTO在NAFLD患者肝臟中是否表達及表達多少、FTO與糖脂代謝等臨床指標的關系如何，目前尚無相關報道。本研究通過回顧性分析NAFLD患者臨床與病理資料，免疫組化檢測其肝穿刺組織中FTO的表達，結合多個臨床指標進行統計學分析，探索NAFLD的發病過程。該研究結果顯示與對照組相比，NAFLD患者糖、脂代謝及肥胖相關各參數均明顯升高，提示FTO可能通過干擾機體糖、脂代謝參與NAFLD的發生、發展；所有NAFLD患者均存在不同程度胰島素抵抗，且胰島素抵抗程度隨著NAFLD肝臟脂肪變程度的加重而加重，FTO蛋白隨肝臟脂肪變加重而表達增加，與本課題組前期實驗結果即高脂孵育不同時間長度的L02肝細胞中FTO mRNA在48 h時表達最高的情況基本一致，說明FTO在肝細胞的表達變化與NAFLD的進展顯著相關，同時也提示FTO可能通過增加胰島素抵抗影響肥胖，進而貫穿于NAFLD發病的全過程。但本研究只對高脂孵育的L02肝細胞中FTO mRNA表達水平進行了測定，并未涉及相關作用通路，這是本研究有所局限的方面，但也為以后的臨床科研工作指明了方向。

現今有關FTO與NAFLD的研究仍相對甚少，FTO在人體內的作用機制也未完全明了，仍需要我們不斷的研究探索，為臨床診治NAFLD及代謝性相關疾病開啟一扇新的大門。

[1]Huang RC, Beilin LJ, Ayonrinde O, et al. Importance of cardiometabolic risk factors in the association between nonalcoholic fatty liver disease and arterial stiffness in adolescents [J]. Hepatology, 2013, 58(4): 1306-1314.

[2]Frayling TM, Timpson NJ, Weedon MN, et al. A common variant in the FTO gene is associated with body mass index and predisposes to childhood and adult obesity [J]. Science, 2007, 316(5826): 889-894.

[3]王小紅, 楊威, 李珊, 等. 肥胖相關基因FTO表達水平與2型糖尿病的相關性[J].中華臨床醫師雜志(電子版), 2014, 8(20): 3606-3610. Wang XH, Yang W, Li S, et al. The correlation of the expression levels of obesity-associated gene FTO and type 2 diabetes mellitus [J]. Chin J Clinicans (Electronic Edition), 2014, 8(20): 3606-3610.

[4]Sun L, Lü SZ. Association between non-alcoholic fatty liver disease and coronary artery disease severity [J]. Chin Med J (Engl), 2011, 124(6): 867-872.

[5]Targher G, Zoppini G, Day CP. Risk of all-cause and cardiovascular mortality in patients with chronic liver disease [J]. Gut, 2011, 60(11): 1602-1603.

[6]Thiruvagounder M, Khan S, Sheriff DS. Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD)-Is it an emerging risk factor for coronary artery disease? Preliminary study in a local Indian population [J]. Sultan Qaboos Univ Med J, 2010, 10(2): 221-226.

[7]Scorletti E, Calder PC, Byrne CD. Non-alcoholic fatty liver disease and cardiovascular risk: metabolic aspects and novel treatments [J]. Endocrine, 2011, 40(3): 332-343.

[8]中華醫學會肝臟病學分會脂肪肝和酒精性肝病學組. 非酒精性脂肪性肝病診療指南(2010年1月修訂)[J]. 中華內科雜志, 2010, 49(3): 275. Fatty Liver and Alcoholic Liver Disease Group Branch of Hepatology . The Chinese Medical Association Nonalcoholic fatty liver disease diagnosis and treatment guidelines (January 2010 amendment) [J]. Chin J Intern Med, 2010, 49(3): 275.

[9]Sallis JF, Glanz K. The role of built environments in physical activity, eating, and obesity in childhood [J]. Future Child, 2006, 16(1): 89-108.

[10]Toperoff G, Aran D, Kark JD, et al. Genome-wide survey reveals predisposing diabetes type 2-related DNA methylation variations in human peripheral blood [J]. Hum Mol Genet, 2012, 21(2): 371-383.

[11]Bravard A, Lefai E, Meugnier E, et al. FTO is increased in muscleduring type 2 diabetes, and its overexpression in myotubes alters insulinsignaling, enhances lipogenesis and ROS production, and induces mitochondrial dysfunction [J]. Diabetes, 2011, 60(1): 258-268．

[12]Zhang Q, Li Y, Liang T, et al. ER stress and autophagy dysfunction contribute to fatty liver in diabetic mice [J]. Int J Biol Sci, 2015, 11(5): 559-568.

[13]Guo J, Ren W, Li A, et al. Fat mass and obesity-associated gene enhances oxidative stress and lipogenesis in nonalcoholic fatty liver disease [J]. Dig Dis Sci, 2013, 58(4): 1004-1009.

[14]Zhang J, Li S, Li J, et al. Expression and significance of fat mass and obesity associated gene and forkhead transcription factor O1 in non-alcoholic fatty liver disease [J]. Chin Med J (Engl), 2014, 127(21): 3771-3776.

(責任編輯：王全楚)

Expression and significance of FTO in liver tissues of nonalcoholic fatty liver disease

WU Xue1,2, MA Yuanyuan1, LIU Xiaogang1, LI Shan1, ZHANG Lixia1, ZHENG Lili1

1.Department of Endocrinology and Metabolism, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052; 2.Institute of Clinical Medicine Research of Universities Henan, China

Objective To study the expressions of the fat mass and obesity associated gene(FTO) in patients with nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD), and investigate the role of FTO in the occurrence and development of NAFLD.Methods Immunohistochemical method was used to detect the expression of FTO protein in liver biopsy tissue, the clinical and biochemical indexes and obesity, insulin resistance and related parameters were analyzed.Results FTO protein expressed in normal control group, nonalcoholic simple fatty liver (NAFL) group and the nonalcoholic steatohepatitis (NASH) group. Compared with normal control group, FTO protein was increased significantly in the NAFL and NASH group (P<0.001); in NASH and NAFL groups, the sugar, lipid metabolism and various indexes such as obesity parameters had obvious difference compared with the normal control group (P<0.01).Conclusion FTO may by interfering with the body’s sugar, lipid metabolism, increase insulin resistance to participate in the occurrence and development of NAFLD.

Fat mass and obesity associated gene； Obesity； Nonalcoholic fatty liver disease

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.11.017

河南省教育廳科學技術研究重點項目(14A320049)

吳雪，醫師，碩士，研究方向：糖尿病及血管并發癥的發生機制。E-mail:392130952@qq.com

鄭麗麗，主任醫師。E-mail：zhengli1012@126.com

R575.5

A

1006-5709(2016)11-1275-04

2016-1-5