人胃癌組織中γδT細胞亞群變化及意義

陳新孚，劉 建，劉軍權，陳光俠，呂小婷，朱 云，費素娟

1. 徐州市第一人民醫院消化科，江蘇 徐州 221002；2. 徐州市第六人民醫院血液科；3. 解放軍第97醫院消化科 生物治療中心；4. 徐州醫學院附屬醫院消化科

人胃癌組織中γδT細胞亞群變化及意義

陳新孚1，劉 建2，劉軍權3，陳光俠1，呂小婷3，朱 云3，費素娟4

1. 徐州市第一人民醫院消化科，江蘇 徐州 221002；2. 徐州市第六人民醫院血液科；3. 解放軍第97醫院消化科 生物治療中心；4. 徐州醫學院附屬醫院消化科

目的 通過檢測人胃癌組織中γδT細胞及其亞群多種效應分子、細胞因子的水平，了解γδT細胞及其亞群的功能變化及意義。方法 選取手術切除的新鮮胃癌組織和正常胃組織(距離癌灶邊緣>5 cm)標本，采用Ⅱ型膠原酶等酶消化法分離成單細胞懸液；流式細胞術檢測γδT細胞顆粒酶B、穿孔素、CD107a和IL-17A、IFN-γ的水平。結果 (1)胃癌組織中CD27+γδT細胞比例顯著高于CD27-γδT細胞的比例及正常胃組織中CD27+γδT細胞比例(P<0.05)；(2)胃癌組織中γδT細胞IL-17A的分泌水平明顯高于正常胃組織(P<0.05)，而顆粒酶B、穿孔素、CD107a等抗腫瘤效應分子的表達與正常胃組織比較，差異無統計學意義(P>0.05)；(3)CD27+γδT細胞IL-17A的分泌水平顯著高于CD27-γδT細胞(P<0.01)，且其在胃癌組織中明顯高于正常胃組織(P<0.05)，在Ⅲ/Ⅳ期胃癌組織明顯高于Ⅰ/Ⅱ期胃癌組織(P<0.05)。結論 (1)胃癌組織中的γδT細胞分泌IL-17A明顯增高；(2)CD27+γδT細胞亞群是胃癌組織中γδT細胞的優勢亞群，并可能通過分泌細胞因子IL-17A參與胃癌的發生、發展。

胃癌；γδT細胞；CD27；IL-17A

根據T細胞受體(T cell receptor，TCR)的不同人體內T細胞分為兩大類，即γδT細胞和αβT細胞。γδT細胞多為CD4-CD8-的雙陰性T細胞(少部分為CD8+)，由TCR信號途徑調節表達的鋅指轉錄因子ThPOK控制著γδT細胞的發育和成熟[1-2]。目前關于γδT細胞與腫瘤之間關系的研究已受到廣泛關注。但關于胃癌微環境中γδT細胞的功能活性的研究報道較少，因此，本實驗檢測了人胃癌組織中γδT細胞及其亞群的變化。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取徐州醫學院附屬醫院2013年7月-2014年8月住院行手術治療的胃癌患者21例，標本采集之前患者均未進行過放、化療，且無HIV、病毒性肝炎及自身免疫性疾病史，未使用過免疫抑制劑。所有患者術后均經病理診斷證實為胃癌。男14例，女7例，年齡33～79歲，中位年齡58歲。所有患者均按照國際抗癌協會臨床TNM分期標準進行分期，其中TNM Ⅰ/Ⅱ期組9例，TNM Ⅲ/Ⅳ期組12例。

1.2 主要試劑和儀器Ⅱ型膠原酶、透明質酸酶及DNA酶Ⅰ(Sigma公司)；FITC標記的鼠抗人穿孔素、CD107A、IFN-γ，APC標記的鼠抗人γδTCR，Percp-Cy5.5標記的鼠抗人CD27，PE標記的鼠抗人IL-17A、顆粒酶 B、淋巴細胞活化劑、固定劑及破膜劑(以上抗體均為BD Biosciences公司)；RPMI 1640培養基、胎牛血清(Gibco公司)；流式細胞儀(BD Biosciences公司)。

1.3 方法

1.3.1 單細胞懸液的制備：由手術切除的胃癌患者胃組織中獲取約2 g新鮮胃癌組織和2 g正常胃組織(距離癌灶邊緣>5 cm)標本，在超凈臺上去除脂肪和組織表面的血液和黏液。分析天平稱重并記錄組織重量，無菌生理鹽水清洗，剪刀剪碎，放置于RPMI 1640培養液中，加入Ⅱ型膠原酶、透明質酸酶及DNA酶Ⅰ，37 ℃恒溫水浴箱中振蕩消化，3～5 min振蕩一次，30 min后提取已消化的細胞懸液，200目濾網過濾，取濾過液離心，棄上清，RPMI 1640液洗滌后加入Percoll分離液中，1 800 r/min離心15 min，分別吸取各密度層的細胞，RPMI 1640液洗滌2次，收集細胞進行相關實驗研究。

1.3.2 γδT細胞(及CD27+/-γδT細胞)穿孔素、粒酶B、CD107a的檢測：采用RPMI 1640培養液(含100 ml/L小牛血清)將淋巴細胞層的細胞調整為1×109/L，離心后加入APC Mouse Anti-Human γδTCR 5 μl和PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD27 5 μl，重懸后室溫避光孵育15 min，再依次加入Fix&Perm中的Reagent A、B各100 μl，重懸后室溫避光孵育15 min，PBS液洗滌，分別加入PE Mouse Anti-Human Granzyme B 5 μl、FITC Mouse Anti-Human Perforin 20 μl和FITC Mouse Anti-Human CD107a 5 μl，重懸并室溫避光孵育15 min，PBS液洗滌后流式細胞儀檢測，BD FACS Diva軟件分析。

1.3.3 γδT細胞(及CD27+/-γδT細胞)IL-17A和IFN-γ的檢測：RPMI 1640培養液(含100 ml/L小牛血清)將淋巴細胞層的細胞調整為1×109/L，加入BD LEUKO ACTVTN GolgiPlug 2 μl置于37 ℃，5% CO2培養箱培養4～6 h，然后按順序分別加入APC Mouse Anti-Human γδTCR 5 μl、PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD27 5 μl、Fix&Perm Reagent A、B各100 μl并重懸室溫避光孵育，加入PE Mouse Anti-Human IL-17A 20 μl和FITC Mouse Anti-Human IFN-γ 2 μl，室溫避光孵育后用PBS液洗滌，流式細胞儀檢測，BD FACS Diva軟件分析。

2 結果

2.1 胃癌組織和正常胃組織中γδT細胞及其亞群的比例胃癌組織中CD27+γδT細胞比例(68.40±1.94)%明顯高于正常胃組織(58.98±3.46)%，CD27-γδT細胞比例(31.60±1.94)%則明顯低于正常胃組織(41.02±3.46)%(P<0.05)。胃癌組織中CD27+γδT細胞比例較CD27-γδT細胞比例明顯升高(P<0.01)。但胃癌組織中γδT細胞比例(11.91±0.81)%與正常胃組織中γδT細胞比例(11.74±0.98)%比較，差異無統計學意義(P>0.05，見圖1A)。

2.2 胃癌組織和正常胃組織中γδT細胞顆粒酶B、穿孔素和CD107a表達水平的比較胃癌組織中γδT細胞顆粒酶B(18.19±1.06)%、穿孔素(7.99±0.88)%和CD107a(90.52±1.11)%的表達水平與正常胃組織中γδT細胞顆粒酶B(15.48±1.98)%、穿孔素(5.62±1.10)%和CD107a(86.10±1.35)%比較，差異均無統計學意義(P>0.05，見圖1B)。胃癌不同臨床分期之間CD27+γδT細胞和CD27-γδT細胞上述三種效應分子表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3 胃癌組織和正常胃組織中γδT細胞IL-17A和IFN-γ分泌水平的比較胃癌組織中γδT細胞IL-17A(7.54±1.37)%的分泌水平明顯高于正常胃組織(3.47±0.69)%，差異有統計學意義(P=0.01)。胃癌組織與正常胃組織中γδT細胞IFN-γ的分泌水平分別為(15.32±2.39)%和(13.22±1.42)%，差異無統計學意義(P>0.05，見圖1C)。

注：N：正常胃組織，T：胃癌組織，GrB：顆粒酶B，PFP：穿孔素。*P<0.05，**P<0.01，NS：P>0.05。

2.4 胃癌組織和正常胃組織中CD27+γδT細胞與CD27-γδT細胞的功能比較胃癌組織中CD27+γδT細胞IL-17A(7.44±1.52)%的分泌水平明顯高于CD27-γδT細胞(1.24±0.43)%及正常胃組織CD27+γδT細胞(3.17±0.63)%(P<0.05)。正常胃組織內CD27+γδT細胞IL-17A的分泌水平顯著高于CD27-γδT細胞(0.50±0.14)%(P<0.01)。然而，顆粒酶B、穿孔素、CD107a和IFN-γ的表達水平在CD27+γδT細胞亞群與CD27-γδT細胞亞群之間比較，差異無統計學意義(P>0.05，見圖2)。

注：CD27+：CD27+γδT細胞，CD27-：CD27-γδT細胞，N：正常胃組織，T：胃癌組織。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，NS：P>0.05。

圖2 CD27+γδT細胞與CD27-γδT細胞IL-17A、IFN-γ水平的比較 A：正常胃組織；B：胃癌組織；C：胃癌組織與正常胃組織

Fig 2 Comparison of the levels of IL-17A and IFN-γ between CD27+γδT cells and CD27-γδT cells A: normal gastric tissue; B: gastric cancer tissue; C: normal gastric tissue and gastric cancer tissue

2.5 γδT細胞及其亞群IL-17A、IFN-γ水平與胃癌臨床分期之間的關系γδT細胞IL-17A的分泌水平在Ⅲ/Ⅳ期胃癌組織內(9.29±2.10)%顯著高于正常胃組織(4.12±0.88)%(P<0.05)。Ⅰ/Ⅱ期胃癌組織內CD27+γδT細胞IL-17A(4.14±0.80)%的分泌水平低于Ⅲ/Ⅳ期胃癌組織(P<0.05)；但CD27-γδT細胞IL-17A的分泌水平在胃癌不同臨床分期之間比較，差異無統計學意義(P>0.05)；另外，IFN-γ的分泌水平在胃癌不同臨床分期之間及CD27+γδT細胞和CD27-γδT細胞之間比較，差異均無統計學意義(P>0.05，見表1)。

表1 γδT細胞IL-17A、IFN-γ水平與胃癌臨床分期之間的關系

注：與Ⅲ/Ⅳ期胃癌組織CD27+γδT細胞組相比，aP<0.05；與正常胃組織相比，bP<0.05。

3 討論

關于γδT細胞的分群方法，目前尚無相關共識，Ribot等[3]研究發現，γδT細胞在胸腺分化過程中就已經形成具有不同功能特性的γδT細胞亞群，這種分化與多種分子機制有關；他們認為CD27可以作為區分小鼠IFN-γ陽性γδT細胞和IL-17陽性γδT細胞的表面標志，即CD27+γδT細胞主要分泌IFN-γ，CD27-γδT細胞主要分泌IL-17。從胰腺、淋巴結和其他組織中(如肺和腸道)分離得到的CD27+γδT細胞刺激后可以分泌IFN-γ，而CD27-γδT細胞刺激后主要分泌IL-17[4]。然而，關于CD27能否作為人體內γδT細胞的表面標志的研究少有報道。我們檢測了人胃癌組織和正常胃組織內γδT細胞及其亞群的比例變化，結果顯示γδT細胞的比例在胃癌組織與正常胃組織內無明顯差異，但是，胃癌組織中CD27+γδT細胞亞群的比例顯著高于CD27-γδT細胞亞群及正常胃組織CD27+γδT細胞亞群，即CD27+γδT細胞亞群為人胃癌組織內主要的γδT細胞亞群。

顆粒酶B、穿孔素和CD107a作為淋巴細胞細胞毒活性的標志[5-7]，其表達水平可以反映淋巴細胞的抗腫瘤活性。本實驗采用流式細胞術檢測人胃癌組織與正常胃組織中γδT細胞及其亞群顆粒酶B、穿孔素和CD107a的表達水平。結果顯示，胃癌組織中的γδT細胞(包括CD27+γδT細胞亞群和CD27-γδT細胞亞群)和NK細胞、NKT細胞及CD8+T細胞等細胞毒細胞類似，也能表達顆粒酶B、穿孔素及CD107a，且胃癌組織中γδT細胞及其亞群顆粒酶B、穿孔素和CD107a的表達水平與正常胃組織比較，無明顯降低，表明在胃癌微環境中γδT細胞及其亞群并沒有表現出與其細胞毒活性相關的免疫抑制。

IL-17家族是人體內重要細胞因子，尤其是IL-17A已被廣泛研究，其多由CD4+T細胞分泌，但也有研究發現γδT細胞也是體內IL-17A的重要來源[8]。相關研究發現γδT細胞在牛結核分枝桿菌卡介苗刺激后IL-17A表達升高，并可促進中性粒細胞在腫瘤灶的聚集和抑制腫瘤生長[9]。但是也有研究發現，在小鼠纖維肉瘤模型中，腫瘤浸潤的γδT細胞表達的IL-17A能促進腫瘤血管生成并促進腫瘤生長[10]。在另一個包含多種不同腫瘤模型的研究中，發現化療后的瘤體內分泌IL-17A的γδT細胞和CD8+T細胞與抑制腫瘤生長有關[11]。我們的實驗結果顯示，胃癌組織中γδT細胞IL-17A的分泌水平比正常組織明顯升高，而Ⅰ/Ⅱ期胃癌組織中γδT細胞IL-17A的分泌水平低于Ⅲ/Ⅳ期胃癌組織，但差異無統計學意義(這也可能與病例數少有關)，然而，Ⅲ/Ⅳ期胃癌組織內γδT細胞IL-17A的分泌水平顯著高于正常胃組織。另外，胃癌組織及正常胃組織中CD27+γδT細胞IL-17A的分泌水平均高于CD27-γδT細胞，且CD27+γδT細胞IL-17A的分泌水平還表現為胃癌組織高于正常胃組織、Ⅲ/Ⅳ期胃癌組織高于Ⅰ/Ⅱ期胃癌組織。CD27+γδT細胞IL-17A的分泌水平與胃癌的發展呈現出明顯的一致性。以上結果表明，隨著胃癌的形成和進展，γδT細胞及CD27+γδT細胞亞群IL-17A的分泌水平是增加的。這種高表達可能與胃腸道黏膜的炎癥-癌變發展途徑密切相關[6]。

我們的實驗結果發現人胃癌組織內CD27+γδT細胞亞群和CD27-γδT細胞亞群雖然IL-17A的分泌水平存在明顯差異，但IFN-γ的分泌水平沒有明顯區別，與此前小鼠體內的相關研究結果并不相同。因此，在人體內不能簡單地用CD27作為γδT細胞的表面標志。然而，根據上述相關結果可以認為CD27+γδT細胞亞群是人胃癌組織中γδT細胞的優勢亞群，且γδT細胞及CD27+γδT細胞亞群可能通過分泌IL-17A參與了胃癌的發生、發展。

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(責任編輯：馬 軍)

The significance of γδT cell from the tumor tissue of human gastric carcinoma

CHEN Xinfu1, LIU Jian2, LIU Junquan3, CHEN Guangxia1, LV Xiaoting3, ZHU Yun3, FEI Sujuan4

1. Department of Gastroenterology, Xuzhou First People’s Hospital, Xuzhou 221002; 2. Department of Hematology, the Sixth People’s Hospital of Xuzhou; 3. Department of Gastroenterology, Biological Therapy Center, the 97th Hospital of PLA; 4. Department of Gastroenterology, the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, China

Objective To investigate the significance of γδT cells by detecting the level of γδT and its effector molecules and secreting different cytokines in human gastric cancer tissues. Methods Freshly excised gastric tumor tissues and normal gastric tissues (being greater than 5 cm from the tumor edge) from gastric carcinoma patients were selected and incubated them with the solution containing collagen Ⅱ and made them into single cell suspensions. A flow cytometer was used to detect the levels of Granzyme B, Perforin, CD107a, IL-17A and IFN-γ. Results Firstly, the proportion of CD27+γδT cells subtype was higher than that of CD27-γδT cells subtype in the gastric carcinoma tissue and it was also higher than the proportion of CD27+γδT cells subtype from normal gastric tissue (P<0.05). Secondly, the level of IL-17A that γδT cells secreted in the gastric tumor tissues was obviously higher than that in the normal gastric mucosa (P<0.05). But, there were no differences in the proportions of Granzyme B, Perforin, CD107a between the gastric tumor tissue and the normal gastric tissue (P>0.05). Thirdly, in the gastric carcinoma tissue and normal gastric tissue, the proportion of CD27+γδT cells subtype secreting IL-17A was obviously higher than that of CD27-γδT cells subtype secreting (P<0.01). Additionally, the proportion of CD27+γδT cells subtype from gastric carcinoma tissue secreting IL-17A was also higher than that of CD27+γδT cells subtype from normal gastric tissue (P<0.05). The proportion of CD27+γδT cells subtype from the Ⅲ/Ⅳ stage gastric carcinoma tissue secreting IL-17A was higher than that from the Ⅰ/Ⅱ stage gastric carcinoma tissue secreting (P<0.05). Conclusion Firstly, in gastric tumor tissue, the level of γδT cells secreting cytokines IL-17A is significantly increased. Secondly, the CD27+γδT cells subtype is the major functional active cells subtype of γδT cells in the gastric carcinoma tissue. Additionally, it may take part in the appearance and development of gastric cancer by secreting cytokines IL-17A.

Gastric carcinoma; γδT cell; CD27; IL-17A

南京軍區醫學科技創新課題(011Z009)

陳新孚，碩士，主治醫師，研究方向：消化道腫瘤的基礎與臨床。E-mail： 626014646@qq.com

朱云，碩士，主任醫師，碩士生導師，研究方向：平戰時部隊官兵消化性潰瘍致病因素及防治。E-mail： xxfwb@cumt.edu.cn；費素娟，碩士，主任醫師，碩士生導師，研究方向：消化道腫瘤的基礎及臨床研究。E-mail： xyfyfeisj99@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.01.005

R735.2

A

1006-5709(2016)01-0020-04

2015-05-05