雞球蟲DNA疫苗在生產推廣過程中的安全性評價

楊錦昌 周曉波

（鹽城市畜牧獸醫站，江蘇鹽城 224002）

雞球蟲DNA疫苗在生產推廣過程中的安全性評價

楊錦昌 周曉波

（鹽城市畜牧獸醫站，江蘇鹽城 224002）

雞球蟲病是雞常見的一種急性流行性原蟲病。以消瘦、貧血、血痢、生長發育受阻為特征；病原為艾美耳屬的7種球蟲，其中危害最大的有兩種：柔嫩艾美耳球蟲和毒害艾美耳球蟲，前者寄生于盲腸中，后者寄生于小腸粘膜中，臨床上往往表現為多種球蟲混合感染。本病以濕熱多雨的夏季多發，主要發生于3個月以內的幼雞，其中以2～7周齡雞最易感，10日齡以內雛雞少發，成年雞感染則不表現癥狀；1月齡左右雞多患盲腸球蟲，2月齡以上雞多患小腸球蟲。一旦發病，重則引起大面積的死亡，輕則導致生長發育受陰，影響其正常生產性能。目前生產實踐中多采用在飼料中添加抗球蟲藥物預防和治療，由于藥物的長期使用，逐漸產生了抗藥性，導致防控效果越來越差。如何找到一種更好的預防辦法是當務之急，使用疫苗防疫可以起到事半功倍的效果。

雞球蟲DNA疫苗；檢測；質粒DNA

雞球蟲DNA疫苗是免疫效果較好的基因疫苗之一。這些疫苗大部分在實驗雞體內可以提供對球蟲卵囊的免疫保護力，但對其安全性的認識只停留在理論分析階段，缺乏對雞球蟲DNA疫苗的生物安全性評價，致其還不能用于生產實際。為了充分評價DNA疫苗的生物安全性，我們選取四種有代表性的球蟲疫苗，分別為pVAX1.0-TA4-IL-2，pVAX1.0-NA4-IL-2，pVAX1.0-EM8-IL-2，pVAX1.0-LDH-IL-2進行試驗。旨在為該疫苗應用的可行性提供相關數據。

1 實驗方法及步驟

1.1 實驗材料及儀器的準備

質粒，主要試劑及儀器的準備，所需溶液及其配置。

1.2 質粒DNA的轉化及制備

用大腸桿菌DH5α制備感受態細胞，按分子常規克隆方法進行DNA轉化。裂解法制備大量質粒，PEG沉淀法進行純化。

1.3 質粒的定量定性及鑒定

分光光度計測定質粒的含量，雙酶酶切質粒，跑電泳進行鑒定。

1.4 試驗動物的分組和免疫

選擇1日齡小公雛，將制備的四種DNA疫苗混合，通過腿部肌肉分別注射給不同組別的實驗動物，同時每組設置PBS注射的空白對照。分組如下：

組別 雞日齡（d） 數量（只） 接種方式 劑量（μg/只） 接種次數（次） 間隔天數（d） 疫苗批次1 1 120 肌肉注射 25 1 0 同一批2 120 肌肉注射 25 3 7 同一批3 14 240 肌肉注射 75 1 0 3個批次7

1.5 引物的設計

根據四種質粒的結構和序列，分別設置四對特異性引物。

1.6 受試動物臨床反應的觀察

每天觀察實驗動物的精神狀態、飲水、進食、糞便、活動及死亡情況等，并進行詳細的記錄。

1.7 質粒在組織中的分布和存留時間

免疫后每2～4周隨機處死5只雞，分別采取血液、心、肝、脾、腎臟、注射部位肌肉，RT-PCR檢測。

1.8 病理學變化檢測

處死試驗雞的同時多點采取心、肝、脾、腎、腸及腿部注射部位肌肉，按常規方法制備石蠟切片，蘇木精——伊紅（H.E）染色方法進行染色并鏡檢分析。

2 實驗結果

2.1 對疫苗的臨床反應

實驗動物免疫前后精神狀態良好；采食量、飲水沒有明顯變化；糞便情況良好；活動情況正常；沒有發生實驗動物突然死亡的情況；說明受試動物對該疫苗無不良生理反應。

2.2 質粒在注射部位及主要臟器的分布和存留

（1）實驗組1組實驗結果如下表：

?

M：.MarkerDL2000，1.陽性對照，2.陰性對照，3.心，4.肝，5.脾，6.腎，7.注射部位，8.血液A：免疫后1個月EM8基因組擴增結果 B：免疫后1.5個月EM8基因組擴增結果C：免疫后2個月EM8基因組擴增結果D：免疫后3個月EM8基因組擴增結果E：免疫后4個月EM8基因組擴增結果

（2）實驗組2組實驗結果如下表：

及注射部位 逐漸減少 2至4月齡 質粒DNA也未與染色體DNA發生整合EM8 心、肝、脾、腎NA4 心、肝、脾、腎檢測基因 檢出部位 變化趨勢 最晚檢出時間 結論TA4 心、肝、脾、腎及注射部位 逐漸減少 3至4月齡 質粒DNA也未與染色體DNA發生整合NA4 心、肝、脾、腎及注射部位 逐漸減少 2至4月齡 質粒DNA也未與染色體DNA發生整合EM8 心、肝、脾、腎及注射部位 逐漸減少 3至4月齡 質粒DNA也未與染色體DNA發生整合LDH 心、肝、脾、腎及注射部位 逐漸減少 2至4月齡 質粒DNA也未與染色體DNA發生整合及注射部位 逐漸減少 3至4月齡 質粒DNA也未與染色體DNA發生整合LDH 心、肝、脾、腎

（3）實驗組3組實驗結果：注射疫苗后，前兩個月三個批次的疫苗均在注射部位組織、心、肝、脾和腎中能擴增出特異性DNA片段，隨著時間的延長，疫苗DNA在體內存在的量越來越少，到2至4月齡，在所有組織中幾乎檢測不到特異性DNA，說明質粒DNA也未與染色體DNA發生整合。

2.3 臟器組織病理學變化

（1）免疫后1個月，組織臟器均未見病理變化。

免疫后免1個疫后月1主個要月組主織要組圖織片圖（片4（0040×0×））A.心 B.肝A. 心C.B脾.肝 CD..脾腎D .腎E.E肌.肌肉肉 FF..十十二二腸腸

2）免疫后1.5個月，組織臟器均未見病理變化。

免疫后1.5個月主要組織圖片（400×）A.心 B.肝 C.脾 D.腎 E.肌肉 F.十二指腸

（3）免疫后2個月，組織臟器均未見病理變化。

免疫后2個月主要組織圖片（400×）A.心 B.肝 C.脾 D.腎 E.肌肉 F.十二指腸

（4）免疫后3個月，組織臟器均未見病理變化。

免疫后3個月主要組織圖片（400×）A.心 B.肝 C.脾 D.腎 E.肌肉 F.十二指腸

（5）免疫后4個月，組織臟器均未見病理變化。

免疫后4個月主要組織圖片（400×）A.心 B.肝 C.脾 D.腎 E.肌肉 F.十二指腸

3 討論

DNA疫苗是近年發展起來的一種新型疫苗，由于它既具有亞單位苗和滅活苗的安全性，又兼備只有毒苗或重組疫苗才具有的誘導保護性免疫應答的特點。DNA疫苗很可能給免疫預防治療領域帶來一場根本性的變革。然而，在大范圍的應用于臨床實驗之前，還有許多急需解決的問題。而首先應考慮的問題就是DNA 疫苗的安全性問題。主要是確定其是否被整合到宿主基因組 DNA中。本試驗室選擇美國食品與藥物管理局（FDA）認可的安全性較高的pVAX1.0作為球蟲DNA疫苗的表達載體。

本試驗通過PCR檢測了四種DNA疫苗在注射部位的存留以及在主要臟器的分布和存留。經，疫苗在免疫后的1～2個月在血液，心臟，肝臟，脾臟，腎臟和疫苗注射部位的肌肉都能檢測到。說明免疫后質?？赡軙S血液分布到各組織，并在組織中停留一段時間。隨著時間的推移，在免疫后的3個月之后就一直檢測不出質粒的存在。說明質粒在機體內經過一段時間的代謝，可以被宿主清除。并且四種質粒DNA的代謝速度較為一致，僅有個別組在免疫后的2個月就檢測不到質粒，分析原因應為由實驗動物的個體差異和實驗動物生活環境差異導致的，并不影響本實驗對四種疫苗的安全性評價。

基因疫苗致使組織產生病理學損害的可能原因有三，一是因質粒純度不夠，宿主菌殘留成分導致過敏反應或毒性反應；二是質粒的表達產物可能具有某種程度的毒性或刺激機體產生超敏反應；三是質粒序列可能與受試動物基因組發生整合，整合后可能導致原癌基因的表達或抑癌基因失活，使被整合細胞發生惡性變。本試驗所應用的質粒DNA本身沒有任何毒副作用，也不刺激機體產生免疫應答，在組織中以附加體的形式存在，并隨著細胞的代謝逐漸消失，不應引起炎性反應，并且質粒DNA為純化制品，細菌蛋白成分已經被最大限度的抽提去除，DNA樣品在紫外分光定量時，純度在95%以上，蛋白質達到“檢不出”的水平，可以認為不存在宿主菌蛋白成分，同時溶解質粒的介質是0.01M pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液，該介質自身無任何毒副作用，也不會“誘導”質粒DNA產生任何毒副作用。因此，雖然質粒DNA分布到了心臟，肝臟，脾臟，腎臟和肌肉，但無可見的組織病理學變化。質粒DNA與受試動物染色體整合的可能性及激活原癌基因或滅活抑癌基因的可能性均很小或無。因此，從理論上來看，不可能導致機體臟器產生組織病理學變化。本試驗結果也進一步印證了這一點。

本試驗在進行生物安全性評定的同時，還對該疫苗的免疫程序進行了初步探索。本試驗發現重復接種后質粒在機體組織中的存留與一次接種后質粒在組織中的存留無太大差別，有關基因免疫是否需要加強免疫說法不一。有報道認為，DNA疫苗免疫大動物一次后即可誘發較好的體液免疫，且持續時間長；但也有報道認為，須經加強免疫后方可達到較高水平。本試驗重復接種組與其他組并沒有太大差別，引起這種結果的原因可能有多種：第一，DNA免疫后肌細胞和如何受納質粒DNA，受納率和受納量是多少還不是很清楚，不同的雞只間可能有差異；第二，不同的受試動物所受納的含有完整表達盒的質粒DNA的量不同，從而導致表達的蛋白量不同，表達量低，相對來說免疫反應就比較弱；第三，不同機體對所表達外源蛋白的免疫應答反應強弱不同。因此在保證安全性的前提下，要探索一種免疫程序延長質粒在組織中的存留時間，使得延長在體內的免疫保護效果。

本試驗也對超劑量接種的情況作了研究，研究表明質粒在三個月的時候已經檢測不到，在組織中也沒檢測到病理變化，因此，超劑量接種對雞體是安全的。

目前國外有關DNA疫苗安全性報道的研究不多，就從本試驗結果來看，實驗中的四種球蟲DNA疫苗對雞體都是相對安全的。

[1]黃金貴，李運娜，張西臣.雞球蟲病疫苗的研究進展[J].中國生物制品學雜志，2011，（8）：983-987.

[2]張擇揚. 四種雞球蟲DNA疫苗在機體組織中的分布和在環境中的釋放[D].南京農業大學，2011.