沙棘葉黃酮對小鼠急性肝損傷的保護作用

李淑珍，武 飛，楊 寧，陳月林

沙棘葉黃酮對小鼠急性肝損傷的保護作用

李淑珍1，武 飛2，楊 寧1，陳月林1

(1．烏蘭察布醫學高等專科學校，內蒙古烏蘭察布012000; 2．烏蘭察布中心醫院，內蒙古烏蘭察布012000)

當今用于治療肝臟疾病的藥物，長期服藥會給患者帶來負作用，因此尋找新型、安全的天然植物源保肝活性物質具有重要意義．探討沙棘葉黃酮對小鼠急性肝損傷的保護作用，為探索保肝藥物提供實驗基礎．通過小鼠灌胃給藥，用四氯化碳(CCl4)制備急性肝損傷模型，用比色法檢測血清谷丙轉氨酶(GPT)、谷草轉氨酶(GOT)、堿性磷酸酶(AKP)活性和肝臟過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量，計算肝指數和進行病理學顯微切片觀察．實驗結果得出:沙棘葉黃酮中劑量組(100 mg/kg)可明顯降低損傷小鼠血清AKP、GPT、GOT含量和肝臟MDA含量，提高肝臟POD、SOD活性．說明一定劑量的沙棘葉黃酮對小鼠急性肝損傷有保護作用，其機理可能與黃酮的抗脂質過氧化作用有關．

沙棘葉黃酮;肝損傷;小鼠模型;保肝作用

肝臟是人體最大的腺體．肝豐富的血供和獨特的形態結構使其代謝極為活躍，不僅是機體重要的代謝器官，而且還具有分泌、排泄和解毒等重要功能．而今用于治療肝臟疾病的藥物，長期服用有時會給患者帶來負作用，因此尋找新型安全的天然植物源保肝活性物質具有重要意義［1－5］．沙棘(Hippophe rhamnoids L．)為胡頹子科植物，其干燥成熟果實系蒙古族、藏族習用藥材，作為傳統中藥自古以來就有廣泛應用，1997年被列入中國藥典治療多種疾病［6］．沙棘果黃酮類化合物具有保肝作用［7］，據研究證明沙棘葉更富含黃酮類化合物，并且從葉中提取黃酮具有原料來源廣泛，成本低廉的優勢［8］．但對于沙棘葉的研究所見文獻甚少，如能拓展對沙棘葉黃酮的研究，可以有效地促進內蒙古沙棘資源的綜合利用．本文以沙棘葉作為材料，探討葉黃酮的保肝作用，為保肝藥物的探索提供實驗基礎，為內蒙古沙棘資源的合理利用提供理論依據．

1 材料與方法

1．1 藥品與試劑 沙棘葉黃酮精制品，總黃酮含量14．89%，由本實驗室制備;在配制灌胃液前濃縮成總黃酮含量為68．12%的濃縮液．聯苯雙酯，浙江萬邦藥業股份有限公司(批號A02150803)．四氯化碳，上海長江化工廠生產，分析純，用前配成0．1%大豆油溶液．谷丙轉氨酶(GPT)、谷草轉氨酶(GOT)、堿性磷酸酶(AKP)、過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所．

1．2 儀器 722分光光度計(上海電子光學技術研究所)，BECKMAN全自動生化分析儀．

1．3 動物分組與處理 昆明種雄性小鼠60只，體重(20±2)g，由內蒙古大學動物實驗中心提供，合格證號:scxk(蒙)2002－0001．將小鼠隨機分為6組，每組10只．分別是正常對照組、CCl4模型組、聯苯雙酯組、黃酮高、中、低劑量組，各組每天灌胃給藥1次．正常對照組和CCl4模型組灌胃150 mg/kg的蒸餾水，聯苯雙酯組灌胃150 mg/kg的聯苯雙酯溶液，黃酮高、中、低劑量組灌胃劑量分別為150、100和50 mg/kg的沙棘葉黃酮溶液，連續7 d．末次給藥后10 h，除正常對照組外，其他各組小鼠腹腔注射0．1%CCl4大豆油溶液10 mL/kg，同時禁食，自由飲水．16 h后眼球取血，分離血清，另取肝臟備檢［9－10］．

1．4 指標測定［11－12］采用試劑盒測定血清GPT、

GOT和AKP．取肝臟稱重，計算肝指數:肝指數= (肝臟重量/體重)×100%．取肝右葉用生理鹽水沖洗后制備成10%的肝勻漿，測定POD、SOD、MDA．另取肝左葉，置10%中性緩沖甲醛溶液中，經脫水→透明→石蠟包埋→切片→脫蠟→HE染色后，在400倍光鏡下觀察肝細胞的病理形態學變化，由烏蘭察布中心醫院病理檢驗室完成．

1．5 統計學處理 各項數據均以x±SD表示，采用SPSS 19．0統計軟件進行方差分析，兩組間均數差異采用單因素方差分析，P＜0．05，差異有統計學意義．

2 結果與分析

2．1 沙棘葉黃酮對小鼠模型肝、脾臟器的影響藥典記載，沙棘果具有健脾消食，止咳祛痰，活血散瘀等功效，沙棘果的主要成分含異鼠李素、異鼠李素－3－β－D－葡萄糖甙、異鼠李素－3－β－蕓香糖甙、槲皮素及山奈酚的低糖甙等黃酮類物質［6］．沙棘葉總黃酮是否也有此作用，本實驗同時做了脾指數的測定，根據實驗結果可知，沙棘葉黃酮對脾臟損傷有抑制作用，但不存在顯著差異，表明沙棘葉總黃酮與果總黃酮成分相近者很少或完全不同．

由表1可知，與正常對照組相比，CCl4模型組肝指數明顯提高(P＜0．01)，表明CCl4可致小鼠肝臟腫大;與CCl4模型組比較，沙棘葉黃酮各劑量組及聯苯雙酯組均有降低肝指數的作用(P＜0．01)，實驗結果說明沙棘葉黃酮能抑制CCl4所致的小鼠肝臟腫大，并且與聯苯雙酯組的治療作用不存在差異(P＞0．05)．

表1 沙棘葉黃酮對小鼠肝指數、脾指數的影響(x±SD，n=10)Table 1 Effect of flavonoids leaves of Hippophe rhamnoids L．on the liver index and spleen index in mice

2．2 沙棘葉黃酮對小鼠模型血清GPT、GOT和 AKP的影響 血清中GPT、GOT、AKP活性反映肝細胞變性、壞死程度，也是檢查肝功能損害最常用、最敏感的指標，本項研究測定了沙棘葉黃酮對模型小鼠血清GPT、GOT、AKP活性的影響，結果如表2所示．

由表2結果顯示，CCl4模型組的 GPT、GOT、AKP活性均極顯著高于正常對照組(P＜0．01)，說明肝受損，造模成功．與CCl4模型組比較，沙棘葉黃酮各劑量組及聯苯雙酯組的AKP、GPT、GOT活性均極顯著低于模型組(P＜0．01)．沙棘葉黃酮各劑量組之間比較，中劑量更接近正常值，說明中劑量組治療效果較好，與聯苯雙酯組比較不存在顯著差異(P＞0．05)．

2．3 沙棘葉黃酮對小鼠模型肝組織POD、SOD和MDA的影響 POD、SOD是體肝內主要的清除自由基及抗氧化酶類．MDA是脂質過氧化產物，其生成量體現了生物膜的受損程度，損傷程度越重，MDA含量越高．他們都和自由基的含量高低密切相關，沙棘葉黃酮對肝組織POD、SOD和MDA的影響，結果如表3所示．

表3結果顯示，與正常對照組比較，CCl4模型組的 POD和 SOD顯著低于正常對照組(P＜0．01)，MDA高于正常對照組(P＜0．05)，說明肝受損明顯，肝內抗氧化酶活力下降，氧化產物增多．與CCl4模型組比較，聯苯雙酯組、沙棘葉黃酮各劑量組的POD和SOD都高于模型組，MDA都低于模型組，說明沙棘葉黃酮具有提高肝內抗氧化活力(POD和SOD)，降低氧化產物(MDA)的作用．其中，沙棘葉黃酮中劑量組的POD、SOD與模型組比較，有極顯著差異(P＜0．01)，MDA有顯著差異(P＜0．05)，且治療效果與聯苯雙酯組比較，不存在顯著差異(P＞0．05)．說明一定劑量(100 mg/kg)的沙棘葉黃酮可達到與聯苯雙酯組同樣的治療效果．

2．4 沙棘葉黃酮對小鼠模型肝臟病理變化的影響參照文獻［13］的方法判斷肝損傷程度，按肝細胞水腫量分級如下:1)0級:肝細胞正常;2)Ⅰ級:肝細胞水腫程度小于整個肝組織切片的25%;3)Ⅱ級:肝細胞水腫量占整個肝組織切片的25% ～50%;4)Ⅲ級:肝細胞水腫量大于整個肝組織切片的50%．

表2 沙棘葉黃酮對小鼠血清GPT、GOT和AKP的影響(x±SD，n=10)Table 2 Effect of flavonoids leaves of Hippophe rhamnoids L．on serum GPT，GOT and AKP in mice

表3 沙棘葉黃酮對小鼠肝組織POD、SOD和MDA的影響(x±SD，n=10)Table 3 Effect of flavonoids leaves of Hippophe rhamnoids L．on the liver tissue of POD，SOD and MDA in mice

病理學檢查顯示:正常對照組鏡下可見肝細胞索結構清晰，肝細胞形態正常，全部屬于0級，顯微結構見圖1A．CCl4模型組鏡下見肝細胞呈大片氣球樣變，肝損傷嚴重，全部屬于Ⅲ級，顯微結構見圖1B．聯苯雙酯組鏡下可見肝細胞大部分形態較正常，只有極個別細胞異常，90%屬于0級，顯微結構見圖1C．沙棘葉黃酮高劑量組肝細胞病變較模型組較輕，肝細胞點狀壞死，60%屬于Ⅱ級，顯微結構見圖1D．中劑量組肝細胞有個別壞死，大部分正常，與聯苯雙酯藥物組幾乎差不多，70%屬于Ⅰ級，顯微結構見圖1E．低劑量組肝細胞病變較模型組略輕，90%屬于Ⅲ級壞死，結構見圖1F．

3 討論與結論

研究保肝作用常用的動物模型是CCl4急性肝損傷模型．CCl4對肝損傷的毒性作用是通過脂質過氧化作用進行的．CCl4進入肝細胞后，經肝微粒體細胞色素P－450酶激活后生成·CCl3，·CCl3可進一步與氧結合，形成具有更強反應活性的CCl3O－基團，這些自由基可攻擊肝細胞膜不飽和脂肪酸發生脂質過氧化，損傷肝細胞膜的結構和功能，使膜通透性升高，導致細胞腫脹壞死［14］．由于CCl4產生的大量自由基損害了肝臟，使肝指數升高．模型組的肝指數顯著高于正常對照組，說明肝臟受損水腫．沙棘葉黃酮高、中、低劑量組可以明顯降低肝指數，表明沙棘葉黃酮可以有效抑制肝臟腫大，降低肝臟的受損程度，從而保護肝臟．

酶學實驗在肝實質損害的診斷中占重要地位，其中應用最廣泛的是轉氨酶(GPT、GOT)，肝內富含這2種酶，據測定整個肝內轉氨酶量約為血清中含量的100倍．當組織發生炎癥或損傷時，細胞膜通透性增加，細胞內轉氨酶泄漏于血中．因此血清中酶活力升高常與肝組織損傷程度呈平行關系，血清轉氨酶活性是肝細胞損害的敏感指標．AKP主要存在于小腸粘膜、腎臟、骨骼和肝臟等組織的細胞膜上，血液中的AKP主要來自于肝臟，因此，測定血清中的AKP也可以判斷肝臟的受損情況［15］．結果顯示，模型組GPT、GOT、AKP都極顯著高于正常對照組(P＜0．001)，說明肝臟受到嚴重損傷;沙棘葉黃酮中劑量組的值低于CCl4模型組而接近于正常對照組的值，可以抑制血清GPT、GOT、AKP的異常升高，從而保護肝臟．POD和SOD是肝內的抗氧化酶，能夠清除自由基，并可抑制自由基啟動的脂質過氧化反應．脂質過氧化產物MDA也可以破壞細胞膜結構，導致細胞腫脹壞死，其含量可反映機體過氧化損傷程度和細胞受損程度．由于肝臟受損，CCl4模型組的酶活力遠低于正常對照組，MDA的含量顯著高于正常對照組，而沙棘葉黃酮組的酶活力顯著高于CCl4模型組．這說明了沙棘葉黃酮可以通過提高POD、SOD酶活性清除自由基，降低MDA的含量，減輕肝受損程度，從而起到保護細胞膜結構與功能的完整作用．

從病理切片可知，CCl4模型組鏡下見肝細胞呈大片氣球樣變，肝損傷嚴重，從形態學上說明造模成功．黃酮治療組中劑量組效果較好，其效果與聯苯雙酯組相當．從形態學上也說明沙棘葉黃酮具有保護肝臟損傷的作用．

根據鄭建仙［11］所著《功能性食品》記載:病理結果陽性，2個轉氨酶中任何一項陽性，可判定受試物具有對化學性肝損傷有保護作用．綜上所述，一定劑量的沙棘葉黃酮具有保肝作用，其作用機制可能是通過提高清除自由基酶的活性，減少自由基引起脂質過氧化反應，維持了肝細胞膜結構和功能完整性，防止轉氨酶外泄來實現的．沙棘葉黃酮對小鼠急性肝損傷的保護作用的研究，對有效篩選抗肝損傷的植物源活性成分有著重要的意義，并且沙棘葉來源廣泛，價格低廉，對沙棘的綜合利用具有更廣闊的前景．

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Research of Flavonoids Leaves of Hippophe rhamnoids L．on Acute Liver Injury Protection Effects in Mice

LI Shuzhen1，WU Fei2，YANG Ning1，CHEN Yuelin1

(1．Wulanchabu Medical College，Wulanchabu 012000，Inner Mongolia; 2．Wulanchabu Central Hospital，Wulanchabu 012000，Inner Mongolia)

Today drugs used to treat liver diseases often bring many negative effects to the patients．It is important to look for a new security active substances from the natural plants to protect liver．Flavonoids of Hippophe rhamnoids L．maybe protect the acute liver injury in mice，and it perhaps provide experimental basis for protective liver medicine．We prepare acute liver injury model in mice with CCl4by gavage，use colorimetric method to measure serum GPT，GOT，AKP activity and liver POD，SOD，MDA content，calculate the liver index and observe liver in pathology slice．Flavonoids leaves of Hippophe rhamnoids L．(100 mg/kg)can reduce serum AKP，GPT，GOT content and liver MDA content obviously，improve liver POD and SOD activity in the injury mice．The certain dosage flavonoids leaves of Hippophe rhamnoids L．can protect liver in acute liver injury model mice．Its mechanism may be related to flavonoids anti-lipid peroxidation．

flavonoids leaves of Hippophe rhamnoids L．;liver injury;mice model;protect liver function

Q949．95;R965．1

A

1001－8395(2016)05－0765－05

10．3969/j．issn．1001－8395．2016．05．026

(編輯 李德華)

2015－09－22

內蒙古自治區教育廳高等學校科學技術研究項目(NJZC14407)

李淑珍(1974—)，女，副教授，主要從事天然產物研究與開發的研究，E－mail:448609108@qq．com