烏桕Cu/Zn超氧化物歧化酶基因克隆及耐鹽性

牛 蓓，宋 君，符 佳，李 銳，郭曉恒，鄒 亮，雍 彬，郭 靜，高孝錦

烏桕Cu/Zn超氧化物歧化酶基因克隆及耐鹽性

牛 蓓1，宋 君2，符 佳1，李 銳1，郭曉恒1，鄒 亮1，雍 彬3*，郭 靜1，高孝錦1

(1．成都大學醫學院，四川成都610106; 2．四川省農業科學院分析檢測中心，四川成都610066; 3．四川師范大學生命科學學院，四川成都 610101)

利用RT－PCR和RACE技術，成功獲得了烏桕Cu/Zn超氧化物歧化酶(SsCu/Zn SOD)的cDNA全長．該序列含有486 bp的完整開放閱讀框(GenBank登錄號為KX169161)，編碼161個氨基酸殘基，推測其相對分子質量為16.304 kDa，等電點為6.57．對應開放閱讀框的基因組序列含有7個外顯子和6個內含子．同源性及保守結構域分析顯示SsCu/Zn SOD和其他物種的Cu/Zn SOD有較高的同源性(67.26% ～88.69%)，含有一個保守的活性區．構建原核表達載體pET32－SsCu/Zn SOD在大腸桿菌BL21(DE3)中表達，誘導出目的蛋白．轉化菌的鹽脅迫實驗顯示，其具有抗鹽脅迫的功能．

SsCu/Zn超氧化物歧化酶基因;克隆;原核表達;鹽脅迫

超氧化物歧化酶(SOD)是清除生物體內超氧陰離子自由基的抗氧化酶［1］．SOD根據結合的金屬離子的不同可以分為三大類，即 Cu/Zn SOD、Fe SOD和Mn SOD［1－2］．在植物中，Cu/Zn SOD是植物體內清除超氧陰離子最主要的SOD酶類，主要以同源二聚體形式存在于細胞質和葉綠體中［2－4］．其含有與SOD活性相關的Cu離子和穩定活性中心結構的Zn離子［5］．該酶與植物的抗旱、抗鹽堿、耐低溫以及耐高溫等多種抗逆性密切相關，受到多種逆境及激素因子的影響［6］．近年來，不同植物中的超氧化物歧化酶基因被陸續克?。?，3，5］，有報道顯示轉SOD基因的細菌［7］和植物［8］在逆境脅迫下，都表現出活性增加或抗性增強的作用．

烏桕為我國四大油料樹種之一，其種子含油量高達41% ～47%［9］，其中飽和脂肪酸含量約為40%，不飽和脂肪酸含量約占60%［10］，脂肪酸的碳鏈長度主要集中在C17—C20，與普通生物柴油主要成分的碳鏈長度類似［11］．因此烏桕生物質能的研究成為近期熱點．由于烏桕具有良好的抗逆性能［12］，而SOD活性高低可以用作植物抗逆性強弱的判斷的標準之一［6－7］．因而，烏桕SOD轉性的研究為進一步分析其抗逆性的可能機理，改良育種提供一定的理論基礎．本研究通過RT－PCR及RACE技術，從烏桕中克隆出Cu/Zn超氧化物歧化酶(Ss-Cu/Zn SOD)的閱讀框及相應DNA序列，對其進行生物信息學分析．構建原核表達載體pET32－Ss-Cu/Zn SOD，轉入大腸桿菌BL21(DE3)，誘導出目的蛋白．并在高鹽脅迫下，對SsCu/Zn SOD基因重組菌的耐受性進行探討．

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 植物材料 烏桕樹葉采集于四川省仁壽縣．幼嫩的葉子采摘后立刻放入樣品保存液中，回實驗室后將樣品凍存于－80℃超低溫冰箱中備用．

1.1.2 菌株及常用質粒載體 大腸桿菌(Escherichia coli)Top10、BL21(DE3)、原核表達載體pET32a(+)均由四川大學生物資源與生態教育部重點實驗室保存．克隆載體pEASY－T購自北京全式金生物技術有限公司．

1.1.3 各種酶、試劑盒及試劑 酶:rTaq酶、Prime-STARTM酶、反轉錄酶M－MLV、各種DNA限制內切酶均購于TaKaRa公司;試劑盒:膠回收試劑盒、植物基因組DNA提取試劑盒、植物總RNA提取試劑盒購于北京天根公司，反轉錄試劑盒購于Takara公司，質粒提取試劑盒購自Omiga公司．瓊脂糖、瓊脂粉、Tris、SDS、IPTG、X－gal購于Fluka，其他化學藥品為進口或國產分析純和色譜純試劑．

1.1.4 引物 引物均由北京華大基因公司合成，如表1所示．

表1 實驗所用引物Table1 Primers used in this study

1.2 實驗方法

1.2.1 烏桕葉RNA的提取 使用北京天根公司植物總RNA提取試劑盒提取烏桕葉片總RNA．用NanoVue超微量分光光度計測定核酸濃度，采用質量分數1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測核酸完整性．

1.2.2 烏桕Cu/Zn SOD基因的克隆 保守區片段、5'端和3'端RECE片段克隆:通過BLAST對比，根據保守區設計一對簡并引物Cu31和Cu32(表1)．用純化的RNA為模板，以oligo(dT)18為反轉錄引物，進行反轉錄．再分別以2個簡并引物和3個特異引物(Cu31、Cu32、Cu51、Cu52和Cu53)以及2個通用引物AP1和 AP2(表1)．通過5'－ RACE和3'－RACE的方法［13］，分別擴增得到Ss-Cu/Zn SOD基因的3'端和5'端片段．對擴增片段跑膠、回收并測序比對驗證其正確性．所有反應程序均為:95℃、5 min;35個循環(94℃、30 s，55℃、30 s，72℃、1 min)，72℃延伸8 min，16℃保溫．所得的產物經電泳檢測，并回收、連接、轉化、測序(北京華大基因公司)．測序結果在NCBI的Blastn進行比對分析，驗證克隆片段是否屬于Cu/Zn SOD基因．

閱讀框和相關DNA序列的克隆:根據前面所得的3'和5'測序結果拼接片段，再根據該片段設計引物Cu ORF1和Cu ORF2，采用高保真PrimeSTARTM聚合酶分別以cDNA和DNA為模板，克隆SsCu/Zn SOD基因的閱讀框序列和相關 DNA序列．反應程序為:95℃、5 min;35個循環(94℃、40 s，50℃、50 s，72℃、2 min)，72℃延伸10 min，4℃保溫．所得的產物經電泳檢測，并回收、連接、轉化、測序(北京華大基因公司)．所得序列在NCBI的Blastn進行比對分析，驗證克隆片段是否屬于SsCu/Zn SOD基因．

1.2.3 烏桕Cu/Zn SOD生物信息學分析 采用生物軟件:DNAMAN 6.0、Primer Premier 5.0．

使用的網上數據庫和在線分析軟件如下:

Blast:http://www．ncbi．nlm．nih．gov/BLAST/ ORF finder:http://www．ncbi．nlm．nih．gov/gorf/ gorf．html

ComputepI/Mw:http://www．expasy．org/tools/pi_ tool．html

Conserved domains:http://www．ncbi．nlm．nih．gov/ Structure/cdd/wrpsb．cgi

SWISS－MODEL:http://swissmodel．expasy．org/ Spidey:http://www．ncbi．nlm．nih．gov/IEB/Research/Ostell/Spidey/

1.2.4 烏桕Cu/Zn SOD基因的原核表達 Cu/Zn SOD基因原核表達ORF的制備:根據所得的閱讀框序列，設計原核表達的特異引物Cuyh1和Cuyh2，以cDNA為模板，獲得Cu/Zn SOD基因的原核表達ORF．PCR程序為:95℃、5 min;35個循環(94℃、30 s，50℃、30 s，72℃、1 min)，72℃延伸10 min，16℃保溫．PCR產物使用DNA純化回收試劑盒回收放入－20℃備用．

載體構建:用 BamHI和 XhoI內切酶將重組pEASY－T－SsCu/Zn SOD質粒和pET32載體進行雙酶切，膠回收后，用T4連接酶在16℃連接過夜，轉化大腸桿菌TOP10，獲得重組表達載體pET32－SsCu/Zn SOD．

原核表達:將構建好的重組質粒pET32－Ss-Cu/Zn SOD轉化到原核表達菌株BL21(DE3)．轉化子于LB培養基中37℃，250 r/m培養至OD600達到0.6，加入終濃度為1 mM的IPTG，誘導4 h后離心收集菌體，加入上樣緩沖液，振蕩懸浮、破碎離心，取上清進行質量分數12%聚丙烯酰胺凝膠(SDS－PAGE)電泳檢測．

1.2.5 烏桕Cu/Zn SOD基因重組菌對鹽脅迫的耐受性 將重組菌置于2 mL LB(含有50 μg/mL Amp)液體培養基中過夜培養，取100 μL將其接入10 mL含Amp的液體LB中培養至OD600為0.6時，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，誘導培養4 h．按1%比例，取500 μL此培養物和對照菌BL21(DE3)分別移入50 mL含800 mmol/L NaCl液體LB培養基(其中含有 IPTG終濃度為1 mmol/L，Amp 50 μg/mL)中．繼續培養2 d，每間隔4 h，利用紫外分光光度儀測定OD600值，繪制生長曲線．實驗均重復3次．

2 結果與分析

2.1 烏桕SsCu/Zn SOD全長cDNA的克隆 根據GenBank中登錄的Cu/Zn SOD基因的保守序列設計簡并引物，以烏桕葉cDNA為模板，通過巢式PCR擴增得到大約526 bp的3'端片段，如圖1 (A)，將得到的片段回收測序．測序結果在NCBI數據庫進行Blastn比對，發現和其他高等植物的Cu/ Zn SOD基因序列有很高的相似性．因此初步推測獲得的序列為烏桕的SsCu/Zn SOD基因片段．根據該序列設計特異引物，采用TdT末端加尾和巢式PCR的方法獲得了長度大約為397 bp的5'端序列如圖1(B)所示．

將獲得的3'端序列和5'端序列進行拼接，得到全長cDNA．用NCBI的ORF finder功能分析后發現這段序列含有一個完整的ORF框，長度為486 bp，編碼161個氨基酸．根據拼接序列，設計一對特異引物Cu ORF1和Cu ORF2對cDNA和DNA分別進行PCR擴增，獲得486 bp SsCu/Zn SOD ORF序列如圖1(C)和ORF對應2 901 bp DNA序列如圖1 (D)．基因GenBank登錄號為KX169161．

圖1 烏桕的SsCu/Zn SOD基因3'端片段、5'端片段、ORF和ORF區的DNA序列的克隆Fig.1 Amplification of the 3'fragments，the 5'fragments，ORF and genomic DNA of SsCu/Zn SOD gene

2.2 烏桕的SsCu/Zn SOD的生物信息學分析利用Compute pI/Mw進行分析，發現成熟肽的分子量為16．304 kDa，等電點為6．57．同源性比對結果顯示，烏桕SsCu/Zn SOD全長氨基酸序列和其他物種有較高的同源性(67．26%～88.69%)，具有一個保守的活性中心序列，其中含有Cu和Zn結合的位點(圖2(A))．保守結構域分析結果也顯示，活性中心位點包含組氨酸52、54、69、86、126和天冬氨酸89．Cu2+結合位點是組氨酸52、54、69和126，Zn2+結合位點是組氨酸69、77、86和天冬氨酸89(圖2 (B))，這和其他已知的Cu/Zn SOD中Cu、Zn離子結合的配基是一樣的，說明了這些配基對 Cu/Zn SOD發揮正常功能非常重要［14－15］．通過 Swissmodel構建蛋白高級結構模型(圖3)結果顯示，該蛋白和庫中2q2l.1．A模型序列有68.46%的一致性．其主要包含8個β折疊和1個無規則卷曲．

圖2 烏桕SsCu/Zn SOD氨基酸序列分析Fig．2 Amino acid sequence analysis of SsCu/Zn SOD from S．sebiferum

圖3 SsCu/Zn SOD的結構模擬Fig．3 structure modeling of SsCu/Zn SOD

2.3 烏桕的SsCu/Zn SOD閱讀框相關的DNA序列分析 將克隆的閱讀框和相關DNA序列在Spider軟件中進行內含子和外顯子分析，結果如圖4顯示，該基因含有7個外顯子和6個內含子，邊界符合AG/GT規則．其活性中心位點的組氨酸52、54位于第2個外顯子上，組氨酸69、86和天冬氨酸89位于第3個外顯子上，組氨酸126位于第5個外顯子上．

2.4 烏桕SsCu/Zn SOD原核表達 將SsCu/Zn SOD基因的ORF與pET32a(+)載體進行重組，構建了原核表達 pET32－SsCu/Zn SOD重組質粒，轉入大腸桿菌 BL21(DE3)表達菌株中，經IPTG誘導后，對表達產物進行了SDS－PAGE電泳檢測(圖5)．

通過對電泳圖的分析，在IPTG的誘導下，含重組質粒的菌中出現了一條大量表達的蛋白條帶，分子量約為34 kDa，除去載體本身含有17.633 kDa的標簽蛋白，即得到一個約為16 kDa的蛋白質，大小和理論預測值相符．

圖4 SsCu/Zn SOD基因區外顯子分析Fig．4 Exon analysis of genomic region of SsCu/Zn SOD

圖5 SsCu/Zn SOD重組蛋白的誘導表達Fig．5 SDS－PAGE analysis of recombinant SsCu/Zn SOD protein

2.5 烏桕SsCu/Zn SOD基因重組菌對鹽脅迫的耐受性 為了進一步了解該基因的功能，將含有空載pET32的大腸桿菌BL21(DE3)和pET32－SsCu/ Zn SOD載體的重組菌BL21(DE3)，分別在正常條件(培養液中IPTG終濃度為1 mmol/L)下進行培養，并繪制生長曲線，如圖6(A)所示．同時，將另外一組含有空載pET32的大腸桿菌BL21(DE3)和pET32－SsCu/Zn SOD載體的重組菌BL21(DE3)分別在高鹽條件(培養液中含800 mM的 NaCl，IPTG終濃度為1 mmol/L)下進行誘導培養，繪制生長曲線，如圖6(B)所示．圖6(A)結果顯示含有重組載體的菌群和含有空載pET32菌群，在正常情況下其生長速度基本接近．而高鹽脅迫下，pET32－SsCu/Zn SOD的菌株比含有空載pET32菌株延滯期縮短，如圖6(B)，生長速度快，說明pET32－Ss-Cu/Zn SOD的菌株對高鹽的抗性比含有空載pET32菌要強．由于pET32－SsCu/Zn SOD的菌株比空載菌株多含有 SsCu/Zn SOD基因，其能在IPTG誘導下表達出重組 SOD，因而推測其重組SOD在耐鹽上發揮一定的作用．

圖6 含pET32－SsCu/ZnSOD大腸桿菌對鹽脅迫的耐受性Fig．6 The tolerance to salt stress of E．coli with pET32－SsCu/ZnSOD

3 討論

本研究從烏桕中分離得到一個Cu/Zn SOD基因．通過同源序列比對及保守結構域分析，發現該基因推測的理論蛋白與其他物種中的同源蛋白同源性較高(67.26%～88.69%)，且具有一個保守的活性中心序列，其中含有Cu2+結合位點(組氨酸52、54、69和126)和Zn2+結合位點(組氨酸69、77、86和天冬氨酸89)．同源建模顯示，該蛋白主要由β－折疊組成，α－螺旋很少，結構核心是8股反平行的β－折疊組成具有拓撲性的桶．有文獻報道Cu2+與4個組氨酸以及一個水配位，構成酶的活性中心，Zn2+與3個組氨酸的咪唑氮及1個天門冬氨酸的羧基氧離子配位，形成扭曲的四面體結構［16－17］．除去Zn2+而保留Cu2+的話，SOD仍然保持較高的活性，而除去Cu2+的酶則失活［6］．

大多數文獻顯示外源SOD基因的轉入能增加生物的抗逆性．如曲妍妍的研究顯示番茄中的葉綠體Cu/Zn SOD基因轉入進煙草中，轉基因煙草與對照相比耐低溫脅迫能力增強［18］．S.C.Lee等將Cu/ Zn SOD在水稻中過表達提高了水稻對冷脅迫的抗性．不過，L.H.Pitcher等［20］將矮牽牛葉綠體Cu/Zn SOD轉化煙草后，煙草中Cu/Zn SOD的活性雖提高了30～50倍，卻沒有提高對百草枯或臭氧引起的氧化損傷的耐受性．綜上可知，SOD轉基因生物在一定程度上可以提高生物對不同脅迫帶來的氧化損傷的抗性，但不同的生物間存在差別，關于其活性與抗逆性直接的關系還需要進一步的研究．本研究為初步了解SsCu/Zn SOD的功能，設計耐鹽性實驗考察重組表達菌在高鹽脅迫下的生長情況．實驗發現重組菌與對照相比具有較明顯的生長優勢，說明SsCu/Zn SOD蛋白在提高重組菌耐鹽性上具有一定作用．這一結論與臧潔等人的研究結論一致．其將鹽角草Cu/Zn SOD基因轉入大腸桿菌，在鹽脅迫下，轉Cu/Zn SOD基因的大腸桿菌生長量與對照菌相比有一定的增加［7］．此外，通過構建原核表達載體，成功獲得與預測分子量相同的目的蛋白質，推測該蛋白可能是烏桕 SsCu/Zn SOD天然二聚體的寡聚單體形式．未來的工作將對目的蛋白進行純化并驗證活性，以求進一步了解該蛋白的功能．

致謝 成都大學自然科學青年基金(2010XJZ29)及成都大學大學生創新訓練計劃孵化培育項目對本文給予了資助，謹致謝意．

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Cloning and Salt-tolerance Analysis of SsCu/Zn SOD Gene from Sapium Sebiferum

NIU Bei1，SONG Jun2，FU Jia1，LI Rui1，GUO Xiaoheng1，ZOU Liang1，YONG Bin3，GUO Jing1，GAO Xiaojin1

(1．School of Medical，Chengdu University，Chengdu 610106，Sichuan; 2．Center of Analysis and Test，Sichuan Academy of Agriculture Science，Chengdu 610066，Sichuan; 3．College of Life Science，Sichuan Normal University，Chengdu 610101，Sichuan)

A full-length SsCu/Zn SOD gene from S．sebiferum containing a 486 bp open reading frame encoding 161 amino acid residues was obtained by RT-PCR and RACE technology，and the gene was deposited into GenBank with the accession number of KX169161．The molecular weight and isoelectric point of the mature protein were predicted to be 16．304 kDa and 6．57，respectively．The genomic region corresponding to the open reading frame has 7 exons and 6 introns．The homology modeling analysis showed that Ss-Cu/Zn SOD shared a high degree of sequence similarity with other plant Cu/Zn SOD(67．26% ～88．69%)and a conserved active region．Recombinant plasmid pET32-SsCu/Zn SOD was constructed and expressed in E．coli BL21(DE3)．Salt stress analysis of transformed bacteria indicated that SsCu/Zn SOD might confer transformed bacteria salt-tolerance．

SsCu/Zn SOD gene;cloning;prokaryotic expression;salt stress

Q946

A

1001－8395(2016)05－0743－07

10.3969/j．issn.1001－8395.2016.05．022

(編輯 陶志寧)

2016－04－02

四川省教育廳自然科學重點基金(12ZB178)

*通信作者簡介:雍 彬，男，博士，主要從事微生物學、生化與分子生物學的研究，E－mail:binyong1225@163．com