減數分裂重組關鍵蛋白MMLLHH11結合蛋白的酵母雙雜交篩選和鑒定

殷 毅平 萍1.上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院泌尿外科，上海市男科學研究所（上海 200001）2.上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院嘉定分院泌尿外科

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減數分裂重組關鍵蛋白MMLLHH11結合蛋白的酵母雙雜交篩選和鑒定

殷 毅1,2平 萍1*
1.上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院泌尿外科，上海市男科學研究所（上海 200001）
2.上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院嘉定分院泌尿外科

摘要目的 探尋減數分裂關鍵重組蛋白MLH1在精子發生中的結合蛋白。方法 以MLH1為誘餌，通過酵母雙雜交系統，在小鼠睪丸組織的cDNA文庫中進行篩選，尋找MLH1的相互作用蛋白并通過GST pull-down和免疫共沉淀的方法進行驗證。 結果 通過酵母雙雜交的篩選，在小鼠睪丸中經四缺板篩出蛋白29個，包括已知的MLH3和PSM2等。通過GST Pull-down和免疫共沉淀驗證了其中一個新的蛋白RHNO1與MLH1的結合。通過Real-time PCR檢測發現RHNO1在睪丸中高表達，提示RHNO1在精子發生中具有重要功能。結論 酵母雙雜交系統是尋找結合蛋白的有力手段，發現了新的MLH1結合蛋白RHNO1,可能參與了減數分裂同源重組。

關鍵詞精子發生;減數分裂;重組蛋白質類

*通訊作者,E-mail:deer16@126.com

Key woorrddss spermatogenesis;meiosis;Recombinant Proteins

男性不育是影響人類健康的重大疾病，減數分裂中同源重組異常是睪丸生精功能障礙的重要原因[1]。同源重組標記物MLH1在精子發生中的減數分裂過程中具有重要作用，但作用機制仍不清楚。為了探索MLH1在減數分裂重組交換中的作用機制，我們通過酵母雙雜交技術篩選小鼠睪丸cDNA文庫，尋找MLH1在同源重組中的結合蛋白并進行篩選研究，為分析MLH1在減數分裂中同源重組的作用機制提供基礎。

材料與方法

一、實驗動物和細胞

實驗中所用小鼠C57BL6J購自上海交通大學醫學院，實驗動物的使用得到上海交通大學醫學院動物倫理委員會的批準。HEK293T細胞購自中國科學院細胞庫。

二、質粒構建

用TRIzol（Invitrogen）提取小鼠睪丸及HEK293T細胞RNA，用PrimeScrip RT reagent Kit （Takara）逆轉錄成cDNA，PrimeSTAR HS DNA 聚合酶（Takara）進行PCR，得到目的基因的CDS，經酶切后（EcoRI、SalI、BamHI，Takara），連接（DNA Ligation Kit，Takara）到相應載體上。MLH1（NM_026810.2）構建到pGBKT7（Clontech）和FLAG（p3xFLAG-myc-CMV-24，Sigma）載體上；mRHNO1（ENSMUSG00000048668）和hRHNO1（NM_001252499.2）構建到GFP （pEGFP-C1，Clontech）和GST（pGEX-5X-3，GE Healthcare）載體上。pGBKT7-MLH1上游引物：5’-ATATGAATTCATGGCGTTTGTAGC A G G A G T - 3’，下游引物：5’-ATATGGATCCTTTAACA-CCGCTCAAAGACT-3’；FLAG-MLH1上游引物：5’-ATATGAATTCTA TGGCGTTTGTAGCAGGAG3’，下游引物：5’- ATATGGATCCTTAACACCGCTCAAAGACT -T-3’； GFP/GST-mRHNO1上游引物：5’-TATAGAATTCGATGCCTCCCAAAAAGAGAC-3’，下游引物：5’- TATAGTCGACCTGTCAGA TCTTCACAAGGA-3’； GFP/GST-hRHNO1上游引物：5’- TATA G A AT T C G AT G C -C T C C C A G A A A A A A A C - 3’，下游引物：5’- T A T A G T C G -ACGGCAGTCAGCTTTTCACAAG-3’。

三、酵母雙雜交

酵母雙雜交實驗按照Clontech公司提供的《Matchmaker GAL4 Two-Hybrid System 3 &Libraries User Manual》操作。酵母雙雜交系統（Matchmake GAL4 Two-Hybrid System），小鼠睪丸組織cDNA文庫（Mate &Plate Library - Mouse Testis）和酵母營養缺陷培養基購自Clontech。將pGBKT7-MLH1載體轉化到AH109酵母中，經過毒性檢測和自激活檢測后，免疫印跡檢測MLH1的蛋白表達。AH109菌株與小鼠睪丸cDNA文庫采用高強度篩選條件，四缺培養板（SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp）加入2.5 mmol/L的3-AT（Sigma）。四缺板上的克隆經X-β-Gal（Sigma）驗證后，PCR檢測插入片段大小（引物為Matchmaker 3/5’ AD LD-Insert Screening Amplimer），并用HaeIII（Takara）酶切以去除重復克隆。提取酵母質粒，電擊轉化至DH5α大腸桿菌中，提取DH5α中的質粒，質粒送到Invitrogen公司測序，測序引物為Matchmaker 3/5’ AD LD-Insert Screening Amplimer。

四、GST pull-down 驗證

將GST-mRHNO1和GST-hRHNO的質粒轉化至BL-21大腸桿菌中，28℃ 1mM IPTG（Sigma）誘導表達5h，收菌后沉淀經PBS重懸、超聲破碎，4℃ 12 000×g，離心15 min，取上清與Glutathione Sepharose 4B beads（G4B，GE healthcare）孵育，純化GST融合蛋白；將FLAG-MLH1質粒用Lipofectamine 2000（Invitrogen）轉染進入HEK293T細胞中，36h后收集細胞，PBS中重懸、超聲破碎，4℃ 12 000×g，離心15 min，取上清與經G4B純化的GST融合蛋白4℃孵育過夜。低速離心去上清后洗凈凝珠，加入蛋白上樣緩沖液，100℃煮10 min后，進行SDS-PAGE電泳、轉膜。蛋白膠進行考馬斯亮藍染色，硝酸纖維素膜進行免疫印跡，檢測FLAGMLH1[2]。

五、免疫共沉淀

將FLAG-MLH1和GFP-mRHNO1或GFP-hRHNO1質粒在HEK293T細胞中共轉染，36h后收集細胞，加入TNE裂解液（10 mmol/L Tris-HCl pH 7.5,150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA and 1% NP-40），冰上裂解2h，4℃12 000×g，離心15min，取上清，加到孵育了兔抗GFP（Abcam）的Protein G Sepharose 4 fast fl ow（GE healthcare）凝珠，4℃孵育過夜。低速離心去上清后洗凈凝珠，加入蛋白上樣緩沖液，100℃煮10min后，進行SDS-PAGE電泳后免疫印跡，檢測FLAGMLH1[3]。

六、免疫印跡

堿裂解法提取酵母蛋白，或TNE裂解液提取HEK293T細胞過表達的FLAG-MLH1和GFP-mRHNO1、GFP-hRHNO1，SDS-PAGE電泳后電轉到硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉，孵育鼠抗Myc（Proteintech）、鼠抗GFP（Clonetech）、鼠抗GAPDH（Proteintech）、鼠抗FLAG（Sigma），T B S T洗滌后孵育H R P偶聯山羊抗兔/鼠I g G （Proteintech），洗滌后用ECL化學發光法經ImageQuant LAS 4000 mini（GE healthcare）檢測目的蛋白。

七、Real-timee PPCCRR

用TRIzol提取小鼠各組織RNA，經NanoDrop 1000（Thermo Scientific）測定濃度，逆轉錄（PrimeScrip RT reagent Kit，Takara）為cDNA后，采用SYBR法（SYBR Premix Ex Taq II Kit，Takara），使用7500實時熒光定量PCR系統（Applied Biosystems）測定目的基因的表達水平。GAPDH上游引物：5-’TGTGTCCGTCGTGGATCTG-A-3’，下游引物：5’-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3’；m R H N O 1上游引物：5’- TA AT T C AT C TC A C G C T G T T - 3’，下游引物：5’-CAAGGCTGTCAACCATTA-3’。

結 果

一、MMLLHH11在酵母中的表達、毒性及自激活檢測

MLH1作為減數分裂重組交換中的標志物，在其中具有重要的作用，但是其具體的作用機制尚不是很清楚，還有待研究。酵母雙雜交是篩選相互作用蛋白的有力工具，前期的研究利用了血液、乳腺及淋巴細胞的cDNA文庫篩選MLH1的結合蛋白[4-6]。為了探討MLH1在同源染色體重組交換中的作用機制，我們利用了小鼠睪丸的cDNA文庫篩選MLH1的結合蛋白。將小鼠MLH1的CDS構建到pGBKT7載體上，轉化到AH109菌株，免疫印跡檢測了MLH1的表達（圖 11AA）。MLH1對酵母的生長沒有毒性（圖 11BB和圖 11CC），但自激活檢測時發現其有輕微的自激活現象（圖 11DD），而2.5 mM 3-AT的三缺板即能抑制其自激活（圖 11EE--GG），而利用四缺板檢測時，其完全沒有克隆長出，表明高強度篩選條件比較適宜（圖 11HH--JJ），而為了避免假陽性的出現，我們采用了2.5 mM 3-AT和四缺板的篩選條件（圖 11II）。

圖1 MLH11在AAHH110099菌株的表達及自激活檢測

二、酵母雙雜交克隆篩選

MLH1的AH109菌株與Y187的小鼠睪丸cDNA文庫雜交之后，觀測到了經典的三葉草(或米奇鼠)結構（圖22AA）。挑選四缺板上長出來的克隆240個，經X-β-Gal驗證，剔除了未變藍的55個假陽性點（圖 22BB），而兩次PCR都未擴增的克隆，也將之去除49個克隆。將PCR產物按照大小分類，并用HaeIII酶切，將重復的克隆去除32個（圖3），共得出克隆104個。

圖2 酵母雙雜交和X-β--GGaall檢測結果

圖3 HaeIIII 酶切去除重復克隆

三、酵母雙雜交測序結果

酵母質粒轉化至DH5α中，經6次電擊轉化，仍有30個克隆轉化不成功，故共送樣68個并測序成功。經在NCBI中序列比對并經去重，得到基因29個基因的mRNA。其中包括MLH1的已知結合蛋白MLH3和PMS2。經過文獻調研、分析，選定了一個新的基因RAD9-HUS1-RAD1 interacting nuclear orphan 1 （RHNO1，ENSMUSG00000048668）。mRHNO1含有235個氨基酸，分子量為27Kd，保守性很高，人、小鼠、大鼠、牛、雞和爪蟾的序列保守，其羧基端的保守性最高（圖 44AA），小鼠和大鼠之間的同源性為89%，人和鼠之間的同源性為70%（圖 44BB）。

圖4 RHNO1保守性分析

四、MLH1和RHNO1相互作用的驗證

通過外源表達、純化GST融合蛋白mRHNO1和hRHNO1，利用GST pull-down技術沉淀HEK293T細胞中過表達的FLAG-MLH1，證明了RHNO1和MLH1的相互作用（圖 55AA）；同時利用免疫共沉淀技術，在HEK293T細胞中同時過表達FLAG-MLH1和GFP-mRHNO1、GFP-hRHNO1，用GFP抗體沉淀相互作用蛋白，也驗證了RHNO1和MLH1的相互作用（圖 55BB）。

五、RHNO1的表達分析

通過Real-time PCR，分析了RHNO1在小鼠各組織中的表達水平，發現其在睪丸中的表達水平最高（圖 6）。這一結果與Germ Online數據庫中的芯片結果一致[7]。

圖5 MLH1和RRHHNNOO11相互作用的驗證

圖6 Real-time PCR 檢測mRRHHNNOO11在各組織中的表達

這些結果表明RHNO1參與了精子發生的調控，其與MLH1的相互作用，提示RHNO1參與了減數分裂中同源染色體重組過程的調控。

討 論

減數分裂同源染色體重組交換是染色體正確分離和正常精子形成的關鍵，染色體分離異常可導致精子發生障礙。許多不育男性睪丸組織學研究表明減數分裂發生異常，同源染色體重組交換錯誤與男性不育的發生密切相關[8]。MLH1在精子發生中具有重要作用，MLH1的缺失導致精母細胞粗線期停滯，引起不育[9]。前期的研究發現，MLH1在粗線期聯會復合體上呈點狀分布，與重組節的分布類似；MLH1的缺失引起重組缺陷，但是聯會正常。因此MLH1被用作同源重組和交叉的標志物[10]。但是，MLH1在同源重組和交叉中的具體分子作用機制尚不清楚。MLH1的功能之一可能是介導了MSH4-MSH5復合物從同源染色體上解離，促進交叉的完成[11]。其另一個功能可能是與MLH3形成MLH1-MHL3復合物，具有核酸內切酶（endonuclease）活性，可能參與了重組中間體的解離[12]。但是，還有更多的問題沒有得到解答。

為了研究MLH1在同源重組中的具體的作用機制，我們通過酵母雙雜交技術尋找MLH1在睪丸中的結合蛋白，發現了一個新的蛋白RHNO1與MLH1相互作用。通過分析RHNO1的序列，發現人、小鼠、大鼠、牛、雞和爪蟾RHNO1的蛋白序列有較高的保守性，尤其是其羧基端（圖 4）。通過GST pull-down和免疫共沉淀，驗證了MLH1與RHNO1的相互作用（圖 5），通過Real-time PCR和免疫印跡發現RHNO1在小鼠睪丸組織中表達水平最高（圖 6），表明RHNO1在精子發生中具有重要功能。由于我們定制的抗體在組織學中的表現不佳，不能檢測其在生精細胞中的定位，暫時還不能明確其在精子發生中具體環節中的作用。研究表明RHNO1能與Rad9-Rad1-Hus1 （9-1-1）復合體及ATR激活因子TopBP1獨立結合，而9-1-1復合體通過募集RHNO1到DNA損傷位點，激活Chk1，啟動DNA損傷修復[13]。并且在人的細胞中敲低RHNO1能夠部分降級紫外線引起的ATR-Chk1信號通路的活性，但不影響9-1-1復合體與染色體的結合，也不影響9-1-1復合體與TopBP1的結合[14]。同時，RHNO1的變異體與遺傳性乳腺癌的發生關系不大[15]。這些結果提示RHNO1的主要功能可能與DNA損傷修復的關系不是很大。由于RHNO1主要表達在睪丸中，并與MLH1相互作用，提示RHNO1可能與MLH1介導的染色體同源重組相關。

參考文獻

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（2015-11-18收稿）

Screening and verifi cation of proteins that interact with MLH1,the key protein in meiosis recombination,by yeast two hybrid screening

Yi Yin1,2,Ping Ping1*
1.Department of Urology,Renji Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai Adrology Institute,Shanghai 200001,China;
2.Department of Urology,Jiaotong Branch of Renji Hospital Affi liated to the Medicine School of Shanghai Jiaotong University
Corresponding author:Ping Ping,E-mail:deer16@126.com

AbstractObjective To screen proteins that interact with MLH1,the key protein in meiosis recombination in spermatogenesis.Metthhooddss Mouse testis cDNA library was screened by the bait of MLH1 using yeast two hybrid system to fi nd proteins interact with MLH1,and the interaction was validated by GST pull-down and co-immunoprecipitation.Resullttss Total of 29 interaction proteins were found on the plate of SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp by yeast two hybrid screening,including the known interaction proteins of MLH3 and PSM2.A new interaction protein was found which was named as RHNO1,and the interaction was confi rmed by GST pull-down and co-immunoprecipitation.The high expression level of RHNO1 in testis revealed by real-time PCR indicates that RHNO1 may have important function in spermatogenesis.Conclusion Yeast two hybrid system is an effective method to fi nd new interaction proteins,and we have identifi ed a new protein (called) RHNO1 interacted with MLH1,which may play roles in meiotic homologous recombination.

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2016.01.004

中圖分類號R321.1