家蠅核糖體蛋白S18基因的克隆及表達模式研究

胡亞盧誠魏川川修江帆，2吳建偉，2

（1. 貴州醫科大學基礎醫學院，貴陽 550004；2. 貴州博康生物工程有限公司，貴陽 550004）

家蠅核糖體蛋白S18基因的克隆及表達模式研究

胡亞1盧誠1魏川川1修江帆1，2吳建偉1，2

（1. 貴州醫科大學基礎醫學院，貴陽 550004；2. 貴州博康生物工程有限公司，貴陽 550004）

旨為證實核糖體蛋白S18（Ribosomal protein S18，RPS18）基因在家蠅體內的表達穩定性。從構建家蠅幼蟲 cDNA文庫中篩選到核糖體蛋白S18基因，以cDNA為模板，通過 PCR 擴增，獲得RPS18基因完整編碼序列（登錄號：KT006855），運用生物信息學方法對該基因及其編碼蛋白進行預測和分析。構建 pET28a/RPS18重組質粒，轉化到大腸桿菌Transetta（DE3）中進行誘導表達及蛋白純化，制備多克隆抗體并進行抗血清特異性分析。應用RT-PCR、qPCR及Western-blot從轉錄、翻譯水平上分析RPS18基因在家蠅不同發育時期和三齡幼蟲不同組織中的表達情況。結果表明，RPS18基因ORF全長459 bp，編碼152個氨基酸，理論分子量為17 590.5 Da，等電點為10.48；將構建的重組質粒轉入大腸桿菌Transetta（DE3）中，純化得到RPS18蛋白；將該純化蛋白免疫大白兔獲得多克隆抗體，His單抗鑒定及抗血清特異性分析顯示，其均可見單一條帶；RT-PCR、qPCR及Westernblot分析表明，RPS18基因在家蠅不同發育時期及幼蟲不同組織均能夠穩定表達；綜合分析表明，該基因在家蠅不同發育時期及幼蟲不同組織均保持較好的表達穩定性。

核糖體蛋白S18（RPS18）；家蠅；內參基因；原核表達；表達模式

管家基因又稱持家基因，是所有細胞中均表達的一類基因，其產物是對維持細胞基本生命活動所必需的［1，2］。該基因一直處于活性轉錄狀態，表達水平受環境因素影響較小，而且是在個體各個生長階段的大多數，或幾乎全部組織中持續表達，它的表達只受啟動序列或啟動子與RNA聚合酶相互作用的影響，而不受其他機制調節。管家基因被認為在轉錄和翻譯水平方面保持恒定，其通常作為內參基因校正上樣量及上樣過程中存在的實驗誤差，保證實驗結果的準確性［3］。隨著對昆蟲功能基因研究的不斷深入，為了獲得真實可靠的實驗數據，實驗通常采用內參基因進行數據校正和均一化［4］，從而對內參基因的研究顯得極為重要，目前通常以微管蛋白基因（α-tubulin、TUA、β-tubulin、TUB）［5］、核糖體蛋白（如RPSs、RPLs）［6］、肌動蛋白（如βactin）［7］、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）［8］、轉錄延伸 因 子 基 因（Transcription elongation factors，EF-1α）、多聚泛素酶基因（ubiquitin，UBQ）、18S核糖體RNA（18S ribosomal RNA，18S rRNA）［9］等管家基因作為內參基因評估昆蟲基因的表達［10］。

目前在真核細胞中發現的核糖體蛋白（Ribosomal protein，RP）有80多種，廣泛分布于各種組織中，核糖體蛋白的命名與蛋白在核糖體的大小亞基有關。小亞基核糖體蛋白命名為S1-S31，大亞基核糖體蛋白命名為L1-L44［11］。越來越多的證據表明，多種 RP除組成核糖體、參與蛋白質生物合成之外，還具有其他的功能［12］，如在哺乳動物和果蠅中，RPS3有核酸內切酶的作用，RPS2基因突變引起卵子發育停滯，RPS10參與轉錄過程中的抗終止作用，RPS12參與RNA的加工過程［13］。核糖體蛋白S18是真核生物核糖體40S亞基的組成蛋白之一，是一種高度保守的蛋白質，屬于核蛋白S13超家族成員，由于穩定表達于不同類型的細胞和組織（如正常細胞和癌細胞）中，而且其表達量近似，并無顯著性差別，近年來已有實驗將其作為內參基因進行研究［14］。

家蠅（Musca domestica）呈世界性分布，是重要的媒介昆蟲，對環境適應能力強，有強大的先天性免疫系統及生長代謝調節功能［15-17］。近年來，對于家蠅功能基因的系統研究已成為研究熱點，從核酸和蛋白水平評估基因的時空表達變化是研究功能基因的基礎。在家蠅中，僅在轉錄水平上對內參基因進行優化選擇研究［18］，但對于蛋白翻譯水平，到目前仍未見相關研究報道。本研究通過對家蠅核糖體蛋白S18（RPS18）基因完整開放閱讀框序列進行基因克隆及原核表達，并通過RT-PCR、qPCR及采用Western-blot從轉錄、翻譯水平上分析其在家蠅不同發育時期和不同組織中的表達情況，評估RPS18基因作為家蠅內參基因的可靠性，旨在為今后進行家蠅功能基因的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物材料與菌種 家蠅由貴州醫科大學病原生物學教研室常規飼養；清潔級新西蘭大白兔，由貴州醫科大學實驗動物中心提供；宿主菌感受態細胞Trans1-T1和Transetta（DE3）購自北京全式金生物技術有限公司；載體pMD18-T和pET28a（N端6×His蛋白純化標簽）購自TaKaRa公司。

1.1.2 主要試劑和儀器 限制性內切酶、T4 連接酶、rTaq酶、MiniBEST小量質粒抽提純化試劑盒，DNA Marker DL2000、羊抗兔IgG/HRP、抗His標簽抗體、protein marker、總RNA提取試劑TRIzol Reagent、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit、DNA凝膠回收試劑盒均購自TaKaRa公司；考馬斯亮藍R-250、EZ-buffers H10*TBST buffer購自上海生工生物工程有限公司；卡那霉素；RPS18抗體由實驗室自制；所用引物由上海生工生物工程公司合成。JY92-IIN超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司），PCR擴增儀（德國Eppendorf公司），冷凍高速離心機（德國Eppendorf公司），凝膠成像系統IQuant400（美國Amersham Pharmacia公司）。

1.2 方法

1.2.1 家蠅幼蟲總RNA的提取及cDNA合成 總RNA的提取按照TaKaRa公司TRIzol說明書進行操作。分別對家蠅不同發育時期（卵、一齡幼蟲、二齡幼蟲、三齡幼蟲、蛹、雌蠅、雄蠅）和三齡幼蟲不同組織（體壁、馬氏管、脂肪體、腸道、唾液腺）提取總RNA，總RNA經電泳檢測，GeneQuant公司核酸定量分析儀測定A260/280比值及濃度，以1 μg總RNA為模板，按照cDNA合成試劑盒說明書分別合成cDNA第一鏈，三齡幼蟲作為基因克隆的模板。

1.2.2 引物設計 根據NCBI公布的家蠅基因組RPS18基因預測序列，篩選到編碼該基因的ORF序列，運用Primer 5.0軟件設計基因克隆引物（F1、R1），成熟肽原核表達引物（F2、R2）。以上引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，其序列如下：F1：5'-ATGTCGCTCGTTATCCCAGAAAAG-3'，R1：5'-TTACTTCTTCTTGGATACACCGACA-3'；F2：5'-CGCGGATCCATGTCGCTCGTTAT-3'，R2：5'-CCC AAGCTTTTACTTCTTCTTGGAT-3'。

1.2.3 pMD18-T/RPS18克隆載體的構建 以上述家蠅幼蟲cDNA為模板，應用基因克隆引物進行PCR擴增，擴增條件：94℃預變性 5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環；72℃延伸10 min。取PCR產物檢測：2%的瓊脂糖凝膠電泳。用DNA凝膠回收試劑盒，純化PCR產物。將PCR產物連接到pMD18-T載體上，轉化Trans1-T1感受態細胞，涂布于Amp+抗性的LB固體培養基平板培養，次日挑單克隆進行PCR鑒定，擴大培養后提取質粒，送生物公司測序。

1.2.4 生物信息學分析 利用瑞士生物信息學研究所的蛋白分析專家系統（Expert Protein Analysis System，ExPASy，http://ca.expasy.org/）提供的生物信息學工具分析家蠅RPS18基因的特點；運用NCBI Blast對基因序列進行同源比對，用ProtParam分析蛋白等電點、分子質量；ProtScale分析蛋白質的疏水性；SignaIP4.1分析信號肽位點；免疫表位數據庫分析資源IEDB Analysis Recource網站（http://tools. immuneepitope.org/tools/bcell/iedb_input）分析抗原表位。

1.2.5 pET28a/RPS18表達載體的構建 以pMD18-T/RPS18質粒為模板，應用表達引物（F2、R2）擴增RPS18序列，PCR反應條件為：94℃預變性5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環；72℃延伸10 min。取PCR產物檢測：2%的瓊脂糖凝膠電泳。PCR產物用膠回收試劑盒回收純化，將純化的PCR產物與原核表達載體pET28a重組，連接產物轉化Transetta（DE3）感受態細胞，涂布于含Kan+抗性的LB平板上，37℃培養過夜，隨機挑取10個陽性克隆，擴大培養后，用質粒提取試劑盒抽提質粒，測序并鑒定。

1.2.6 家蠅RPS18重組蛋白的誘導表達和純化及Western-blot鑒定 將重組質粒pET28a/RPS18轉入Transetta（DE3）。挑取陽性克隆接種于5 mL LB培養液中37℃，200 r/min過夜培養。取菌液3 mL于100 mL LB培養液中37℃培養。當OD600檢測值是0.6時，加入IPTG至終濃度為0.25 mmol/L，34℃，繼續培養18 h。用12% SDS-PAGE檢測重組蛋白表達情況。誘導菌液離心10 000 r/min，10 min收集菌體，裂解緩沖液重懸菌體，超聲裂解懸浮液（160 W，超聲2 s，間歇5 s，循環數90）。懸浮液4℃、13 000 r/min離心30 min，收集上清和沉淀，根據Ni-IDA Agarose蛋白純化說明書操作進行純化，12% SDSPAGE判斷重組蛋白的可溶性。用兔來源的抗6×His單克隆抗體（1∶2 000）為一抗，羊抗兔IgG-HRP（1∶2 000）為二抗，進行Western blotting鑒定純化的家蠅RPS18融合蛋白。

1.2.7 多克隆抗體的制備及抗血清特異性分析 將純化好的重組蛋白作為抗原免疫新西蘭大白兔，600 μg分為4次注射，蛋白質與等體積的完全弗氏佐劑充分混勻，皮下多點注射新西蘭大白兔，初次注射量為300 μg。加強免疫每次間隔10 d，蛋白質與等體積的不完全弗氏佐劑充分混勻，皮下多點注射新西蘭大白兔，注射量為100 μg，4次免疫后間隔7 d再進行采血，并分離血清。500 μL/管分裝，-80℃保存。同時以注射PBS的新西蘭大白兔作為陰性對照。

以新西蘭大白兔抗家蠅RPS18重組蛋白血清和初次免疫前新西蘭大白兔陰性血清為一抗（1∶20），以羊抗兔IgG-HRP為二抗（1∶2 000），進行Western blotting分析家蠅RPS18重組蛋白的免疫原性。1.2.8 RPS18基因轉錄水平研究 通過RT-PCR方法，以家蠅不同發育時期（卵、一齡幼蟲、二齡幼蟲、三齡幼蟲、蛹、雌蠅、雄蠅）和三齡幼蟲不同組織（體壁、馬氏管、脂肪體、腸道、唾液腺）cDNA為模板，用F1、R1為引物擴增RPS18序列，PCR反應條件為：94℃預變性5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環；72℃延伸10 min。取PCR產物檢測：2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測家蠅不同發育時期和不同組織RPS18基因的表達。

RPS18的qPCR，按照TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTMII（Perfect Real Time）試劑盒說明，使用ABI PRISM 7500（ABI，USA）進行Real-time PCR，每個反應3個重復。反應體系總體積為20 μL，其中SYBR Premix Ex Taq II（2×）10 μL、上下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL、ROX Reference Dye II（50×）0.4 μL、cDNA 2.0 μL；滅菌蒸餾水補足體積。反應程序為：95℃預變性30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個循環。反應結束后，確認qPCR的熔解曲線鑒定產物的特異性。

1.2.9 RPS18基因翻譯水平研究 提取不同發育時期（卵、一齡幼蟲、二齡幼蟲、三齡幼蟲、蛹、雌蠅、雄蠅）家蠅及家蠅三齡幼蟲不同組織（體壁、馬氏管、脂肪體、腸道、唾液腺）總蛋白，用Western-blot檢測RPS18的表達情況。

2 結果

2.1 家蠅pMD18-T/RPS18克隆載體構建

選用克隆引物進行PCR 鑒定重組質粒，結果（圖 1第1泳道）顯示，提取重組質粒進行測序鑒定，確定插入片段連接方向正確。

圖 1 pMD18-T/RPS18及pET28a/RPS18重組質粒 PCR鑒定

2.2 生物信息學分析

家蠅RPS18蛋白基因全長為459 bp，編碼152個氨基酸（圖2）。 序列已上傳 NCBI GenBank，登錄號：KT006855。ExPASy中 ProtParam預測RPS18的理論分子量17 590.5 Da，其等電點為10.48。280 nm處的摩爾消光系數為 16 960 M-1cm-1，0.1%濃度的ABS為0.964。若其成熟肽N-末端為蛋氨酸時，在哺乳動物網織紅細胞體外表達的半衰期為30 h，在酵母和大腸桿菌中表達的半衰期分別>20 h和>10 h。在溶液中RPS18 的不穩定指數為47.41，其性質不穩定，RPS18的疏水指數為90.99，疏水性較高（圖3）。

圖2 RPS18基因開放閱讀框cDNA序列及對應編碼的氨基酸序列

圖3 ProtScaler軟件RPS18的疏水性分析

2.3 家蠅pET28a/RPS18表達載體構建

選用組合引物：表達目的基因上游+下游組合；質粒 T7啟動子+質粒T7終止子；目的基因上游+質粒T7終止子；質粒T7啟動子+目的基因下游進行PCR鑒定重組質粒。結果（圖 1第2、3、4、5泳道）顯示，提取重組質粒進行測序鑒定，顯示表達載體構建成功。

2.4 家蠅pET28a/RPS18重組蛋白表達、純化鑒定及抗體制備

2.4.1 家蠅pET28a/RPS18重組蛋白表達及純化將鑒定為陽性的重組表達質粒導入到表達菌株Transetta（DE3）中，經終濃度為0.25 mmol/L的IPTG誘導18 h獲得重組蛋白。SDS-PAGE電泳分析結果（圖4）顯示，在約21 kD處有外源蛋白表達條帶出現（pET28a載體His標簽及部分載體蛋白大小約為3.2 kD），與預期分子量一致。將蛋白進行純化，結果（圖3第7泳道）證明目的蛋白純化成功。

圖4 12% SDS-PAGE分析pET28a/RPS18在大腸桿菌Transetta（DE3）中表達純化效果

2.4.2 HIS單克隆抗體檢測RPS18重組蛋白 用兔來源的抗6×His單克隆抗體作為Western-blot中的一抗，其能夠識別家蠅RPS18純化蛋白，出現特異性目的條帶，結果進一步證實RPS18基因原核重組表達成功，重組蛋白帶有His純化標簽（圖5第1、2、5、6、9、10泳道）。

2.4.3 RPS18重組蛋白抗血清特異性檢測 將純化的RPS18重組蛋白分別與重組蛋白免疫的新西蘭大白兔的抗血清相互作用，在約21 kD（圖6第1、2、5、6、9、10泳道）可見一明顯的免疫反應條帶，其大小與預測RPS18重組蛋白分子量相近，陰性對照血清（圖6第3、4、7、8、11、12泳道）在相應的位置未識別出條帶，說明制備的多克隆抗體能與RPS18蛋白產生特異的免疫印跡反應。

圖5 His單克隆抗體鑒定純化的RPS18重組蛋白的表達

圖6 RPS18重組蛋白的抗血清特異性分析

2.5 RPS18基因轉錄水平的研究

2.5.1 RT-PCR檢測RPS18基因的表達 以家蠅不同發育時期和三齡幼蟲不同組織cDNA為模板，進行RT-PCR擴增，均能擴增出特異性條帶（圖7，圖8），說明RPS18基因在家蠅不同發育時期及不同組織間呈一致性表達，且表達量較為穩定。

2.5.2 qPCR檢測RPS18基因的表達 通過軟件GraphPad Prism 5，采用CT值法對RPS18基因在家蠅生活史中各齡期及不同組織中的表達進行統計學分析并以CT Value為縱坐標、各齡期或三齡幼蟲不同組織為橫坐標作圖。結果表明，RPS18基因的qPCR分析，CT值線性范圍為19-21之間（圖9，圖10）。

圖7 家蠅不同組織RPS18基因的擴增結果

圖8 家蠅不同發育時期RPS18基因的擴增結果

圖9 RPS18基因在家蠅生活史不同發育時期的表達

圖10 RPS18基因在家蠅三齡幼蟲不同組織的表達

圖11 家蠅不同組織RPS18蛋白的表達

圖12 家蠅不同發育時期RPS18蛋白的表達

2.6 RPS18基因翻譯水平的研究

將提取的家蠅不同發育時期及三齡幼蟲不同組織總蛋白進行Western-blot分析，結果（圖11，圖12）顯示，約在21 kD處均顯示有目的蛋白。

3 討論

選擇理想的內參基因對獲得準確的基因表達結果是至關重要的，選擇適當的內參基因以減少檢測標本間的差異是必須的［19］，因此內參基因的表達水平應相對穩定且受環境影響較小。家蠅孳生于雜亂菌叢的環境中傳播疾病，是重要的媒介昆蟲，其免疫防御、免疫協助得到很多研究者的關注，而目前為止沒有一個內參基因能夠作為家蠅功能基因研究的參照和參考依據，但對于其他昆蟲（如娥［20］發現β-tubulin和β-actin基因在金紋細蛾不同發育階段蟲態間表達最穩定；β-actin和18S基因在金紋細蛾成蟲不同組織間表達最穩定；蚊［21］rspL40、BTF3在不同組織中表達最穩定，rspL40、rsp5在吸血不同時相表達最穩定）已有關于穩定內參基因的相關報道，此外對于家蠅內參基因的研究僅限于轉錄水平［18-22］，且在不同組織及發育時期能夠穩定表達，與本研究結果一致，對于翻譯水平，到目前仍未見相關研究報道。本研究從家蠅幼蟲cDNA 文庫中篩選到核糖體蛋白S18基因序列，全長459 bp，編碼152個氨基酸，理論分子量為17 590.5 Da，等電點為10.48。成功克隆了RPS18基因，并插入pET28a表達載體，選用pET系統是因為該載體具有很強的表達重組蛋白的能力，而本實驗選用的pET28a載體本身包含His序列，使載體表達的重組蛋白含有His融合標簽，獲得高純度和高濃度的重組蛋白，并成功制備血清抗體，His單抗鑒定及抗血清特異性分析其均可見單一條帶。本研究從轉錄水平和翻譯水平上對家蠅不同發育時期、三齡幼蟲不同組織間RPS18基因的表達穩定性進行了研究，結果顯示RPS18基因在家蠅不同發育時期及幼蟲不同組織間均能夠穩定表達。綜合分析顯示，該基因在家蠅不同發育時期及幼蟲不同組織均保持了較好的表達穩定性，同時在一定程度上證明此次家蠅內參基因篩選結果的準確性和可靠性，但對于不同脅迫條件（冷、熱刺激、微生物感染等）下該基因的穩定性有待進一步研究。本研究將為今后家蠅基因表達的研究提供依據和參照，為進一步對家蠅功能基因的研究奠定基礎。

4 結論

本研究成功構建pET28a/RPS18重組原核表達載體并表達出RPS18蛋白，獲得純化蛋白及其抗體。在轉錄和翻譯水平上證明，RPS18基因在家蠅不同發育時期及幼蟲不同組織間均保持了較好的表達穩定性，同時證實此次家蠅內參基因的篩選結果是準確可靠的。

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（責任編輯 馬鑫）

Cloning and Expression Pattern of Ribosomal Protein S18 Gene in Musca domestica

HU Ya1LU Cheng1WEI Chuan-chuan1XIU Jiang-fan1，2WU Jian-wei1，2
（1. Basic Medical College，Medical University of Guizhou，Guiyang 550004；2. Guizhou Bokang Bioengineering Co.，Ltd，Guiyang 550004）

This research is to confirm the expression stability of ribosomal protein S18（RPS18）gene in Musca domestica. The complete coding sequence（Registration number in NCBI：KT006855）of RPS18 gene was obtained via PCR amplification using the cDNA of RPS18 gene from the cDNA library of M. domestica larva as a template，further the gene and its encoding protein were predicted and analyzed by bioinformatics method. The constructed recombinant plasmid of pET28a/RPS18 was transferred into Escherichia coli Transetta（DE3）for the induced expression and protein purification，and the polyclonal antibody was prepared as well as the specificity of antiserum was analyzed. The transcription and translation expressions of RPS18 gene at different growth stages of the M. domestica larva and in the different tissues of 3-year larva were analyzed by RT-PCR，qPCR and Western blot. The results showed that the RPS18 ORF was 459 bp in length encoding 152 amino acids with a predicted molecular mass of 17 590.5 Da and pI of 10.48. The recombinant plasmid was transferred into E. coli Transetta（DE3），and the purified protein RPS18 was acquired. The purified protein was immunized to rabbits，then the polyclonal antibody was harvested，and the single band was visualized by both His single resistance identification and antiserum specificity analysis. The analysis by RT-PCR，qPCR and Western blot indicated that RPS18 genes expressed stably in different growth stages and different tissues of the larva. In conclusion，comprehensive analysis suggests that the gene may maintain solid stability in different growth stages of M. domestica and different tissues of larva.

ribosomal protein S18；Musca domestica；reference genes；prokaryotic expression；expression pattern

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.019

2015-09-16

國家自然科學基金項目（81360254），國家科技部支撐計劃課題子課題（2011BAC06B12），貴州省科技廳聯合基金項目（黔科合LH字［2014］7076號），貴州省衛生計生委科學技術項目（gzwjkj2014-2-100），貴州省高等學校創新能力提升計劃（07060151306）

胡亞，女，碩士研究生，研究方向：醫學昆蟲免疫及應用；E-mail：hooyaa@126.com

吳建偉，男，博士生導師，研究方向：醫學昆蟲免疫及應用；E-mail：wjw@gmc.edu.cn