青香蕉蘋果α—法尼烯合酶基因啟動子的克隆及序列分析

王亞男　劉曉楠　戚偉　宋媛媛　張渝潔　成妮妮

【摘 要】α-法尼烯的合成及α-法尼烯合酶基因的表達調控機制的研究在蘋果等虎皮病的防治中具有重要作用。本實驗利用Tail-PCR技術克隆了青香蕉蘋果中α-法尼烯合酶基因的啟動子序列，長度為1235bp。序列分析結果發現，該啟動子序列含有明顯的啟動子特征序列TATA-box和CAAT-box，還有含有GARE-motif，TATC-box，TGA element等赤霉素和生長素等激素響應元件，HSE，ARE等熱脅迫響應元件，大量的光反應元件G-box，GA-motif，GAG-motif，以及MYB結合位點MBS。序列分析表明該啟動子可能受到激素、溫度和光的調節。

【關鍵詞】α-法尼烯合酶；啟動子；虎皮病

α-法尼烯是一種普遍存在于植物體內的倍半萜類次生代謝物質，研究發現果皮中α-法尼烯的生物合成是通過類異戊二烯途徑中的甲羥戊酸途徑[1-2]。多年來的研究普遍認為，在儲存過程中倍半萜α-法尼烯在果皮尤其是果皮蠟質中的積累是引起蘋果和梨果實中的重大生理病害—虎皮病的主要原因[3-6]。Busatto等（2014）研究發現，α-法尼烯及其氧化產物共軛三烯（CTols）一個新的作用即作為蘋果果實褐變的信號開關。研究表明蘋果虎皮病發生過程中多酚提取液的變化也與乙烯合成抑制劑1-MCP有關。這些代謝物積累的變化與參與這個途徑的基因以及兩種特異的揮發物α-法尼烯和共軛三烯（Ctols）的最終氧化形式6-甲基-5-庚烯-2-酮（MHO）關系密切[7]，這與Whitaker等（2000）報道的MHO 與蘋果虎皮病發病率之間存在正相關關系，且只有在發病的果實上才能檢測到MHO一致[6]。候真等（2013）在研究MHO對蘋果虎皮病發生和果皮活性氧代謝的影響時發現，外源MHO可能通過降低抗氧化酶活性，進而參與蘋果虎皮病的發病過程[8]。而Xie等（2014）研究還發現，梨（‘dAnjou，Pyrus communis L.）果實儲存過程中，在乙烯產生和成熟度與虎皮病發生方面對1-MCP非常敏感[9]。

通過以上研究發現，α-法尼烯及其氧化產物與虎皮病發生關系密切，而α-法尼烯含量及α-法尼烯合酶表達模式可能受到1-MCP影響或乙烯的調節。因此，僅通過研究α-法尼烯合酶基因本身很難真正闡明虎皮病發生的分子機制，尤其是研究外界環境對虎皮病發生率的影響時，此時α-法尼烯的產生與其代謝途徑中的關鍵酶的表達量有重要關系。

本文擬通過分離α-法尼烯合成途徑的最后一個關鍵酶α-法尼烯合成酶基因的啟動子序列，對其結構進行分析，研究其所含有的順式作用元件，為下一步植物表達載體的構建，以及光、激素、溫度、氧氣等因素對啟動子調控的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

青香蕉蘋果幼苗；大腸桿菌DH5α，本實驗室保存；Ex Taq DNA聚合酶，dNTP Mix，pMD18-T載體克隆試劑盒，Genome Walking Kit，購自大連寶生物工程有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司。測序由上海生物工程有限完成。

1.2 方法

1.2.1 蘋果幼葉基因組DNA的提取

采用新型植物基因組提取試劑盒（DP320）（天根生化科技（北京）有限公司），具體步驟參照說明書。

1.2.2 引物設計

利用熱不對稱交織 PCR（thermal asymmetric interlaced PCR，Tail-PCR）技術擴增α-法尼烯合成酶基因的啟動子序列。根據GenBank中注冊的青香蕉蘋果α-法尼烯合成酶基因（AFS）cDNA序列（張元湖，李萌等，2004，登錄號AY563622），在起始密碼子下游約400bp的長度內設計3條退火溫度較高（60℃以上）的特異引物SP1，SP2，SP3，引物方向為需要擴增的未知區域方向。同時設計了5條退火溫度較低（44℃）的簡并引物。

特異引物：SP1： 5- GCCTAGTTTTCGGACGCTGTCAATG-3；SP2： 5-TTCCGATACTCATCTCCCTGC ACTCAGTT-3；SP3： 5- AGTAAG AGGCTTCAGGTTCGGGTTTCAT-3。

簡并引物：Genome Walking Kit 自帶引物AP1-AP4。

1.2.3 Tail-PCR過程

PCR擴增程序參照Genome Walking Kit說明書

第1次PCR：以獲得的青香蕉蘋果幼葉的基因組DNA為模板，以SP1分別與簡并引物AP1-AP4配對，進行目的片段的PCR擴增。第2次PCR：將第1次PCR產物稀釋1000倍為模板，以SP2分別與AP1-AP4配對，進行目的片段的擴增。第3次PCR：將第2次PCR產物稀釋500倍為模板，以SP3分別與AP1-AP4配對，進行目的片段的擴增。每次反應完成后，取5μLPCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 產物回收及測序

用天根生化科技（北京）有限公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒切膠回收第 3次 PCR產物較長較亮片段，回收片段克隆進pMD 18- T載體中并進行測序。

1.2.5 α-AFS啟動子順式作用元件分析

利用plantCARE結合PLACE在線預測軟件對青香蕉蘋果的啟動子序列進行順式作用元件預測和比較分析。

2 結果與分析

2.1 3次Tail-PCR產物的電泳結果

圖1 三次TAIL-PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳分析

（A，B，C）分別代表1，2，3次TAIL-PCR產物的電泳結果。M：DNA Marker DL 2 000；泳道1，2，3，4分別代表特異引物與簡并引物AP1-AP4分別配對的PCR產物。

由圖1A看出，各引物對擴增的產物都以彌散帶為主，從圖1B看出，第2次PCR中SP2與AP1組成的引物對擴增產物中出現兩條比較亮的條帶（泳道1），一條約750bp，一條約1400bp，其它3對引物出現2條200-300bp的條帶，其它帶較為彌散。圖1C看出，各引物對都出現750bp以上的較亮條帶，且每對引物的最大條帶豐度都較高。

2.2 目的片段回收及測序

分別切膠回收圖 1 C泳道1和泳道4中較大的條帶（約1400bp），泳道2和泳道3中最亮的條帶（約1800bp）的PCR產物，克隆進pMD 18-T 載體中測序。測序結果顯示泳道1和泳道4的產物長度為1320bp，與GenBank中注冊的青香蕉α-法尼烯合成酶基因cDNA序列（登錄號AY563622，張元湖，李萌等，2004）的重疊區域比較后，初步確定該序列為青香蕉蘋果中α-法尼烯合成酶基因的上游序列，命名為pAFS。而泳道2，3的產物長度為1771，1863，但是在與青香蕉α-法尼烯合成酶基因cDNA重疊區比對時未發現重疊區序列，說明泳道2，3的產物為非目的帶。

2.3 pAFS啟動子結構分析和順式作用元件預測

利用PLACE和PlantCARE 網站對pAFS片段進行啟動子元件的在線分析預測表明，該序列具有許多明顯的TATA框和CAAT框，同時還具有與激素相關的元件（圖2），如位于ATG上游-41和-65處以TATC-box為核心的赤霉素響應元件TATCCCA，分別位于該片段負連-727和-904處的兩個GARE-motif序列AAACAGA是赤霉素反應元件，位于ATG

上游負連上-192處的AACGAC是生長素反應元件。該序列負連的-1196還具有MYB結合位點MBS，其核心序列為 TAACTG。以上各種元件的存在說明該序列的功能可能跟激素相關。同時，在ATG下游+34和負連的+48處分別有一個HSE元件AGAAAATTCT和ARE元件TGGTTT，前者參與熱脅迫反應，后者是厭氧誘導所必須的，說明該啟動子可能還受溫度和氧氣的調節。另外，該啟動子還具有大量的與光反應有關的元件如G-box，GA-motif，GAG-motif等。而且在ATG上下游附件各種調控元件相對集中。

3 討論

近年來，諸多研究表明蘋果虎皮病發生過程中，內源乙烯的含量與α-法尼烯合酶基因的表達和α-法尼烯的含量具有一定的相關性，Pechous等（2005）等對AFS1基因的轉錄產物mRNA進行Northern雜交的分析表明乙烯合成抑制劑-甲基環丙烯（1-MCP）處理后，AFS1的mRNA在冷藏4周后則快速下降，到第8周則已經幾乎檢測不到[10]。另有研究表明，在整體上，1-MCP處理的果實中α-法尼烯合酶基因的轉錄水平比未處理的要低[11]。這些實驗都說明了乙烯誘導AFS1基因的轉錄。由α-法尼烯合酶表達模式受乙烯調節表明，該酶基因啟動子可能有響應乙烯調節的順式作用元件。這些實驗結果都為研究與乙烯誘導表達量增加有關的AFS基因啟動子區域乙烯響應元件提供了有價值的信息，很多實驗室已開始著手對包含乙烯響應元件的AFS基因啟動子進行克隆研究。

本實驗利用熱不對稱交織PCR（Tail-PCR）技術，克隆了青香蕉蘋果中α-法尼烯合成酶基因起始密碼子ATG上游約1235bp及下游83bp序列，經PLACE軟件分析后發現其具有多個啟動子特征序列TATA-box和增強子特征序列CAAT-box，同時具有G-box等多個光反應元件和多種激素反應相關元件。在ATG下游還具有一個高溫反應元件HSE，由此推測該序列具有啟動子功能，且可能與激素、高溫、光等因素的調控相關。為了研究該啟動子的核心區域及各調控元件的調控作用，我們目前正在利用啟動子刪除技術和定點突變技術構建一系列與GUS報告基因相連的表達載體，通過GUS活性檢測，對啟動子個序列的功能進行更細致的研究。

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[責任編輯：楊玉潔]