GnRH-α對人子宮內膜基質細胞增殖和遷移的影響

焦婷婷，陳金嬋，張燁敏，惠　寧

(第二軍醫大學附屬長海醫院 婦產科，上海200433)

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*通訊作者

GnRH-α對人子宮內膜基質細胞增殖和遷移的影響

焦婷婷，陳金嬋，張燁敏，惠寧*

(第二軍醫大學附屬長海醫院 婦產科，上海200433)

摘要：目的探討促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-α)對人子宮內膜基質細胞增殖和遷移的影響。方法原代體外培養人子宮內膜基質細胞，加入不同濃度的GnRH-α，MTT法檢測人子宮內膜基質細胞增殖的變化情況，Transwell小室法檢測人子宮內膜基質細胞遷移的變化情況。結果與空白對照組相比較，GnRH-α處理細胞后，人子宮內膜基質細胞在10-7g/ml濃度組和10-6g/ml濃度組增殖減少(*P<0.05，**P<0.01 vs 空白對照組)，在10-8g/ml、10-7g/ml和10-6g/ml濃度組細胞遷移均增加(*P<0.05，**P<0.01 vs 空白對照組)。結論GnRH-α可以抑制人子宮內膜基質細胞的增殖，促進人子宮內膜基質細胞的遷移，從而影響胚胎的著床過程。

關鍵詞：GnRH-α；人子宮內膜基質細胞；增殖；遷移；胚胎著床

(ChinJLabDiagn,2016,20:0722)

胚胎著床是胚胎與母體相互作用的復雜過程。當胚胎著床時，開始母嬰對話，子宮內膜基質細胞和胎盤滋養層細胞相互作用。人的子宮內膜基質細胞具有增殖和遷移的能力，它們對胚胎植入時子宮內膜容受性的起著關鍵作用。目前對子宮內膜對胚胎著床的作用研究主要集中在兩方面，一是在超聲下觀察內膜的運動情況并進行分型研究；二是從細胞層面研究子宮內膜細胞的增殖和遷移能力。目前的研究認為子宮內膜的增殖和遷移能力是影響IVF-ET術中移植術的重要因素，它可以有效的預測妊娠的結局[1]。促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-α)是將天然GnRH十肽結構中的某些氨基酸進行置換或去除，形成人工合成的化合物，提高與受體結合的親和力，從而作用于下丘腦-垂體-卵巢性腺軸，影響激素的合成和分泌。目前GnRH-α制劑已廣泛應用于婦科子宮內膜異位癥患者的治療以及輔助生殖技術的控制性超排卵當中。但是關于GnRH-α對人子宮內膜基質細胞增殖和遷移能力的研究，國內外鮮有報道。本實驗通過研究GnRH-α對人子宮內膜基質細胞增殖和遷移的影響，探討其在胚胎著床中的作用。

1材料與方法

1.1主要材料和試劑原代培養的人子宮內膜細胞(經長海醫院和中國人民解放軍第二軍醫大學倫理委員會批準，在病人知情同意的前提下，子宮內膜組織獲取自2012年12月1日至2013年10月31日在長海醫院生殖中心因不孕癥行宮腔鏡檢查的患者，共14例。年齡23-35歲，平均(29.63±6.17)歲，需術后病理證實為增殖期子宮內膜)，DNA酶Ⅰ型購于美國Sigma公司，Ⅱ型膠原酶購于WASHINGTON公司，胎牛血清、 DMEM 培養基購于美國Gibcol公司，MTT試劑盒(購于北京碧云天生物公司)，Transwell 小室購于美國corning公司，曲普瑞林(Triptorelin)購于德國輝凌制藥公司。

1.2人體外子宮內膜基質細胞的原代培養和傳代取宮腔鏡下刮取的少量人子宮內膜組織，反復沖洗3次，標本剪碎成 1 mm3的小塊組織。將內膜置于F12 DMEM培養液配置的消化液中(DNA酶，終濃度為0.5 mg/ml；Ⅱ型膠原酶，終濃度為1.5 mg/ml；BSA，終濃度為1 mg/ml)，37℃，120-130轉/分，搖動水浴消化40-60 min。收集上層液體，用胎牛血清終止消化，600 rpm×3 min離心沉淀未消化完全的組織。棄沉淀，收集上清液，以1 100 rpm×10 min離心沉淀細胞。棄上清液，重懸細胞沉淀，經400目(孔徑38 μm)不銹鋼細胞濾網過濾(在培養皿中進行) 。網上細胞團主要為腺上皮細胞。將濾液(主要為基質細胞)接種25 cm細胞培養瓶中。將培養瓶置于37℃，5 % CO2培養箱中培養。貼壁30-40 min后，全量更換培養液以去除不貼壁的腺上皮細胞和血細胞(基質細胞在40 min內貼壁，腺上皮細胞貼壁時間大于30 min)。48 h后全量更換培養液，當細胞貼壁生長達到瓶底的80%-90%時進行傳代。

1.3MTT法檢測GnRH-α對人子宮內膜基質細胞增殖的影響將對數生長期的P1代人子宮內膜基質細胞用胰酶消化傳代，以2000/孔的密度接種于96 孔板中培養，加藥48 h后終止反應，每孔入10 μl MMT，37 ℃孵育2 h，用酶標儀450/650 nm測定每孔OD值，每孔設5個平行副孔。

1.4Transwell小室法檢測GnRH-α對人子宮內膜基質細胞遷移的影響，P1代子宮內膜基質細胞，加藥處理，種板前血清饑餓24小時。用胰酶消化處于對數生長期的子宮內膜基質細胞，以含 1%胎牛血清的 F12DMEM 培養基調整細胞濃度為5× 105個/ml。迅速加入200 μl 細胞懸液于 transwell 上室，于下室加入1 ml含 10%胎牛血清的F12DMEM培養基以及各組藥物。將 24孔板置于細胞培養箱，37℃孵箱中培養 48 h，取出小室，用 PBS 液輕洗小室濾膜兩側，PBS 浸濕的無菌棉簽輕拭去濾膜上室面的細胞。將transwell小室微孔濾膜用固定液固定10 min ，DEPI染色后，在熒光顯微鏡下觀察穿膜細胞數，取上、下、左、右、中心選 5個視野，計數濾膜下室面的細胞數。

1.5統計分析所有數據均使用SPSS17.0分析，數據均以均數±標準差表示，多組間差別用單因素方差分析 (ANOVA) 進行統計。P<0.05和P<0.01均表示差異顯著。

2結果

2.1體外原代培養的人子宮內膜基質細胞

在顯微鏡下觀察原代培養的人子宮內膜基質細胞，呈梭形排列,胞質薄而透明,核橢圓,呈分散形生長。如圖 1所示，A圖為普通光學顯微鏡 100×放大。B圖為普通光學顯微鏡 200×放大。

2.2不同濃度GnRH-α對人子宮內膜基質細胞增殖的影響

對P1代的人子宮內膜基質細胞加入不同濃度的Triptorelin進行處理，實驗分為空白對照組，10-8g/ml濃度組，10-7g/ml濃度,10-6g/ml濃度組；MTT法檢測GnRH-α對人子宮內膜基質細胞增殖的影響，結果顯示基質細胞的增殖隨著Triptorelin濃度的升高而降低，其中在10-7g/ml濃度組差異具有統計學意義(*P<0.05 vs 空白對照組)，在10-6g/ml濃度組差異顯著(**P<0.01 vs 空白對照組)。如圖2所示。

圖1原代培養的人子宮內膜基質細胞圖2不同濃度GnRH-α對人子宮圖3不同濃度GnRH-α對人子宮

內膜基質細胞增殖的影響內膜基質細胞遷移的影響

2.3不同濃度GnRH-α對人子宮內膜基質細胞遷移的影響

對P1代的人子宮內膜基質細胞加入不同濃度的Triptorelin處理，實驗分為空白對照組，10-8g/ml濃度組，10-7g/ml濃度,10-6g/ml濃度組；Transwell法檢測GnRH-α對人子宮內膜基質細胞遷移的影響。結果顯示基質細胞的遷移隨著GnRH-α濃度的升高而增加，在10-8g/ml濃度組(*P<0.05 vs 空白對照組)和10-7g/ml濃度組(*P<0.05 vs 空白對照組)差異具有統計學意義，在10-6g/ml濃度組差異顯著(**P<0.01 vs 空白對照組)。如圖3、4所示。

A：空白對照組；B：10-8g/ml濃度組；C：10-7g/ml濃度；D:10-6g/ml濃度組

圖4熒光顯微鏡下細胞遷移情況圖

3討論

胚胎植入是指從胚胎著床到胎盤形成的復雜的一個生理過程。在這一過程中，胚胎發育到胚泡階段開始著床，子宮內膜增殖分化到容受性狀態，胚胎和母體間相互協作，共同完成。多種細胞因子、轉錄因子和激素等參與該過程。胚胎植入失敗是臨床上早期流產和IVF-ET術中胚胎移植失敗的關鍵因素。

目前對于胚胎植入過程分子機制的研究尚不是十分清楚。Paria等人認為胚胎在著床時向母體子宮內膜發出的第一個信號分子可能是運動信號，而非化學信號。隨后子宮內膜上皮細胞和基質細胞將這一運動信號分子轉變為化學信號分子[2-4]。子宮內膜基質細胞一方面開始增殖和遷移，與絨毛膜外細胞滋養層細胞的定位形成互動，另一方面分泌多種細胞因子、生長因子和激素等促進胎盤滋養層細胞的侵襲[5-10]。

人的子宮內膜基質細胞具有強大的增殖和遷移能力。在女性的月經周期中，月經過后，子宮內膜基質細胞運動和增殖，在內膜增殖期時形成新的內膜層。月經期，基質細胞在多種因素的作用下遷移到子宮腔以外，并種植形成子宮內膜異位癥[11-14]，在妊娠中，子宮內膜基質細胞遷移和侵襲的研究也受到了重視。Brosens等人認為妊娠后的子宮內膜基質細胞的運動能力較前有所提高[14]。子宮內膜異位癥患者易形成不孕，可能與月經期基質細胞運動功能不同所致[11]。在研究絨毛膜外細胞滋養層細胞和基質細胞共培養的體系中，Ferreira等人發現轉化生長因子-β(TGF-β)和人絨毛促性腺激素(HCG)可以促進子宮內膜基質細胞的遷移[15,16]。 總之子宮內膜基質細胞的增殖和遷移能力對胚胎植入的過程具有非常重要的意義。

GnRH-α在注射初始時可以使垂體的GnRH數量增加，12小時內發生“flare-up”效應，持續作用4-5天后，垂體對其產生的刺激不再反應，呈現去敏感引起相反作用，用藥21天后，體內激素水平可以達到絕經期水平。子宮內膜細胞，內膜萎縮,內異癥病灶縮小。由GnRH-α的這一特殊作用，目前已廣泛用于臨床子宮內膜異位癥的治療和輔助生殖技術中控制性超排卵長方案的應用。Meresaman發現GnRH-α可以抑制子宮內膜異位癥患者體外培養的子宮內膜細胞的增殖并促進細胞的凋亡[17]。Borroni等發現GnRH-α可在體外對內異癥異位內膜細胞的增殖起直接抑制作用[18]。這種作用可能是通過下調VEGF的表達實現的，并且這一作用可以被促性腺激素釋放激素拮抗劑(GnRH-A)逆轉。在GnRH-α與子宮內膜基質細胞的運動中的作用的研究報道，國內外并不多見，Arver認為GnRH-α可能通過激活cAMP通道作用促進子宮內膜基質細胞和胎盤滋養層細胞的運動互動[19,20]。

本實驗的研究結果顯示GnRH-α可以在體外直接抑制人子宮內膜基質細胞的增殖，促進基質細胞的遷移。說明GnRH-α不僅可以通過影響性激素的改變進而作用于子宮內膜，還可能直接影響子宮內膜基質細胞的增殖和遷移能力。這一結果為GnRH-α用于治療子宮內膜異位癥引起的不孕癥提供了的新理論支持，也為胚胎著床的研究提供了新的研究方向，從而進一步為IVF-ET術中反復胚胎移植失敗的病人提供了新的治療思路。但是GnRH-α是通過怎樣的機制作用于人子宮內膜基質細胞的增殖和遷移仍然需要我們進一步的研究。

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Effects of GnRH-α on proliferation and migration of human endometrial stromal cells

JIAOTing-ting,CHENJin-chan,ZHANGye-min,etal.

(DepartmentofObstetricsandGynecology,ChanghaiHospitalofSecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the influence of GnRH-α(gonadotropin-releasing hormone agonist) on proliferation and migration of human endometrial stromal cells.Methodsculture the primary human endometrial stromal cells (ESCs),We added different concentrations of GnRH-αinto ESCs.The proliferation of ESCs was examined by MTT assay,and the transwell chamber assay was used to detect the migration of ESCs.ResultsCompared with the blank control group,GnRH-α significantly reduced the proliferation of human endometrial stromal cells,and increased cell migration(*P<0.05，**P<0.01 vs blank).ConclusionGnRH-α can inhibit the proliferation of human endometrial stromal cells and promote the migration of human endometrial stromal cells,which may affect the process of embryo implantation.

Key words:GnRH-α；human endometrial stromal cells；proliferation；migration；embryo implantation

基金項目：上海市科委基金項目(09411966600)

文章編號：1007-4287(2016)05-0722-04

中圖分類號：R711.7

文獻標識碼：A

作者簡介：惠寧，女，碩士，主任醫師。研究方向：婦科腫瘤與生殖醫學。

(收稿日期：2015-09-15)