吉林地區(qū)人群HPA-1～6，15系統(tǒng)基因多態(tài)性分析

楊　帆，韓　瑜，焦立新△，魯　威，金成日，陳　琳△，牛　潼，李俊瑋

(1.吉林省血液中心，吉林 長春130033；2.吉林大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院)

?

△共同通訊作者

吉林地區(qū)人群HPA-1～6，15系統(tǒng)基因多態(tài)性分析

楊帆1，韓瑜1，焦立新1△，魯威1，金成日1，陳琳1△，牛潼2，李俊瑋2

(1.吉林省血液中心，吉林 長春130033；2.吉林大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院)

摘要：目的調(diào)查吉林地區(qū)人群人類血小板抗原(HPA)基因多態(tài)性。方法采用PCR-SSP方法對419名血小板捐獻(xiàn)志愿者進(jìn)行血小板抗原HPA-1～6，15系統(tǒng)基因分型，通過統(tǒng)計(jì)方法對分型結(jié)果進(jìn)行基因多態(tài)性分析。結(jié)果血小板抗原HPA-1～6，15系統(tǒng)基因頻率分別為HPA-1aa 0.984，HPA-1ab 0.016，HPA-2aa 0.872，HPA-2ab 0.123，HPA-2bb 0.004，HPA-3aa 0.350，HPA-3ab 0.483,HPA-3bb 0.166，HPA-4aa 0.992，HPA-4ab 0.008，HPA-5aa 0.996，HPA-5ab 0.004，HPA-6aa 0.984，HPA-6ab 0.016，HPA-15aa 0.318，HPA-15ab 0.492，HPA-15bb 0.190。結(jié)論吉林地區(qū)人群HPA-1～6和HPA-15系統(tǒng)基因多態(tài)性具有本地區(qū)特點(diǎn)，HPA-3和HPA-15系統(tǒng)不配合率最高，HPA-2系統(tǒng)次之。

關(guān)鍵詞：人類血小板抗原；基因型;PCR-SSP

(ChinJLabDiagn,2016,20:0750)

人類血小板抗原(human platelet antigen，HPA)均存在于血小板膜糖蛋白上(GP)，由血小板特有的抗原決定簇組成，表現(xiàn)血小板獨(dú)特的遺傳多態(tài)性，血小板多態(tài)性是由單一核苷酸改變或一對堿基置換引起個(gè)別氨基酸的不同形成的，采用基因定型方法可以對HPA抗原進(jìn)行鑒定。至今被國際輸血協(xié)會(huì)組織確認(rèn)的血小板特異性抗原已有28個(gè)，除1個(gè)抗原(Moua抗原)尚未達(dá)到命名要求，有12個(gè)抗原被列入6個(gè)遺傳系統(tǒng)，分別命名HPA-1～5 和HPA-15，還有15個(gè)抗原尚未達(dá)到系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)(http://www.ebi.ac.uk/ipd/hpa/)[2]。這幾個(gè)系統(tǒng)與血小板輸注無效、輸血后紫癜、新生兒同種免疫血小板減少性紫癜等疾病有關(guān)。因此，我們對本血液中心機(jī)采血小板固定獻(xiàn)血者的HPA-1～6、15系統(tǒng)基因多態(tài)性做了研究，并對這419名漢族人群做HPA-1～6、15基因型及基因頻率統(tǒng)計(jì)分析，報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1研究對象為本血液中心固定獻(xiàn)血者419名，定期捐獻(xiàn)機(jī)采血小板，籍貫分布在吉林省內(nèi)各個(gè)地區(qū)，均為漢族，男性284名、女性135名，年齡18-55 歲(平均35歲)。獻(xiàn)血者捐獻(xiàn)血小板時(shí)留取全血標(biāo)本3-5 ml/(人)份(EDTA抗凝)，備用。

1.2試劑與儀器人類血小板抗原HPA-1～6，15基因分型試劑盒(201403004，天津秀鵬公司)；PCR 儀(C1000 Touch型，美國Bio-Rad公司)；DNA提取試劑盒(Lot N2905，德國 QIAGEN公司)；凝膠成像分析儀(UVP，JY04S-3C，北京六一儀器)；超微量微孔板分光光度計(jì)(Epoch，美國 Bio-Tek 公司)。

1.3DNA提取從EDTA抗凝試管中取標(biāo)本全血500 μl/份，用試劑盒提取DNA，按說明書操作，DNA濃度(50-100)ng/μl、純度1.6-1.8。

1.4HPA1-6,15基因的PCR擴(kuò)增按照試劑盒說明書操作：配制 Buffer-酶-樣本混合液，分別向每個(gè)引物孔各加入10 μl，上PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增，首先96℃變性3 min，變性、退火、延伸，循環(huán)35次，最后72℃延伸3 min至4℃；取擴(kuò)增產(chǎn)物10 μl，在2% 瓊脂糖凝膠中(含溴化乙錠1 μg/μl)電泳15 min，電泳緩沖液為0.5%TBE溶液，凝膠成像分析儀觀察結(jié)果并拍照。

1.5統(tǒng)計(jì)分析通過統(tǒng)計(jì)方法對分型結(jié)果進(jìn)行基因多態(tài)性分析。計(jì)算公式如下：等位基因頻率：f(a)=〔2×純合子數(shù)+雜合子數(shù)〕/〔2×總的個(gè)體數(shù)〕，f(b)=1- f(a)，表現(xiàn)型頻率 ：f(aa)=〔f(a)〕2,f(ab) =2 f(a) f(b),f(bb) =〔f(b)〕2；不配合率=2ab(1-ab)；a、b分別代表a和 b基因頻率。

2結(jié)果

在HPA-1～6和HPA-15系統(tǒng)基因頻率分布具有多態(tài)性，其中HPA-3和HPA-15系統(tǒng)雜合度最高，HPA-2系統(tǒng)雜合度較高。值得注意的是HPA-2基因多態(tài)性分布具有吉林地區(qū)特點(diǎn)(見表1)。

表1　血小板抗原HPA-1～6，15系統(tǒng)基因頻率

3討論

輸血、妊娠或器官移植后有些患者可產(chǎn)生抗HLA或血小板抗原的抗體，這些抗體可縮短血小板生存時(shí)間，導(dǎo)致患者在接受隨機(jī)獻(xiàn)血者的血小板時(shí)發(fā)生輸注無效[1]。血小板輸注無效主要由同種異體免疫因素造成，由于反復(fù)輸注血小板，血小板特異性抗原的多態(tài)性使患者體內(nèi)發(fā)生免疫反應(yīng)，產(chǎn)生血小板同種抗體。血小板特異性抗原(HPA)不合可導(dǎo)致輸血后紫癜(PTP)、血小板輸注無效(PTR)、新生兒同種免疫性血小板減少性紫癜(NAITP)等。根據(jù)近幾年研究以及以往的研究數(shù)據(jù)表明[3]血小板抗原HPA-1～6，15系統(tǒng)基因分型存在明顯的多態(tài)性并具有普遍臨床意義，本研究采用PCR-SSP方法對419例吉林地區(qū)人群做血小板抗原HPA-1～6，15系統(tǒng)基因分型并進(jìn)行基因多態(tài)性的分析，依據(jù)結(jié)果得出本地區(qū)HPA基因多態(tài)性及分布特點(diǎn)，HPA-3、HPA-15系統(tǒng)雜合子ab頻率高于aa純合子，HPA-l、HPA-4、HPA-5、HPA-6系統(tǒng)均則以aa純合子居多，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析HPA-15系統(tǒng)不配合率最高，HPA-3系統(tǒng)次之。其中值得注意的是HPA-2系統(tǒng)不配合率僅低于前兩者，結(jié)果表明吉林地區(qū)(2a基因型頻率為0.934，2b基因型頻率為0.066，不配合率為0.116)均高出廣東地區(qū)[4](2a基因型頻率為0.9，2b基因型頻率為0.05，不配合率為0.0905)，具有吉林地區(qū)特點(diǎn)。

在臨床血小板輸注過程中，如果血小板同種抗原不相匹配，可導(dǎo)致受血者機(jī)體產(chǎn)生血小板同種抗體，HPA抗原不配合的比例越高，產(chǎn)生抗體的機(jī)會(huì)就會(huì)越多。血小板輸注無效時(shí)，應(yīng)尤其注意HPA-3和HPA-15配合性輸注，患者如為aa或bb純合應(yīng)盡量選擇同型供者。另外，此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)以下基因型頻率較低：HPA-1ab 0.016、HPA-2bb 0.004、HPA-4ab 0.008、HPA-5ab 0.004、HPA-6ab 0.016，為HPA低頻率基因型的血小板輸注無效患者提供了保障，可以根據(jù)患者病情選擇同型(或配合型)單采血小板，避免輸注后發(fā)生抗原抗體反應(yīng)。

此次實(shí)驗(yàn)中的捐獻(xiàn)者均為固定機(jī)采血小板捐獻(xiàn)者，并且均已加入血小板資料庫，本研究為建立吉林地區(qū)HPA基因多態(tài)性資料數(shù)據(jù)庫奠定了基礎(chǔ)，進(jìn)一步為HPA同種免疫導(dǎo)致血小板輸注無效患者提供HPA基因型相合的血小板，最終使血小板庫為臨床能夠更安全、更有效地輸注血小板提供保障。

參考文獻(xiàn)：

[1]張欽輝.臨床輸血學(xué)[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,2000：12.

[2]Kim HO，J in Y，Kickler TS，et al．Gene frequencies of the five major humanplatelet antigens in African American，white，and Korean populations[J]．Transfusion,1995,35：863.

[3]于江虹,楊帆,焦立新,等.長春地區(qū)無償獻(xiàn)血者HPA1-6,15基因分型及頻率調(diào)查[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2011,15(4):680.

[4]陳莉.廣東地區(qū)漢族人群血小板HPA基因庫的建立和初步應(yīng)用的研究[D].廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2009：1-41．

HPA-1～6,15 system gene polymorphism analysis in jilin

YANGFan,HANYu,JIAOLi-xin,etal.

(ChangchunBloodstation,Changchun130033,China)

Abstract:ObjectiveSurvey the crowd in jilin area human platelet antigen (HPA) gene polymorphism.MethodsThe PCR-SSP method in 419 platelet donors for genotyping antigen HPA_1-6,15 system,the statistical method to classification results for gene polymorphism analysis.ResultsThe frequency of HPA pherotype is HPA-1aa 0.984,HPA-1ab 0.016,HPA-2aa 0.872,HPA-2ab 0.123,HPA-2bb 0.004,HPA-3aa 0.350,HPA-3ab 0.483,HPA-3bb 0.166,HPA-4aa 0.992,HPA-4ab 0.008,HPA-5aa 0.996,HPA-5ab 0.004,HPA-6aa 0.984,HPA-6ab 0.016,HPA-15aa 0.318,HPA-15ab 0.492,HPA-15bb 0.190.ConclusionHPA-1～6,15 system are polymorphic gene frequency distribution,the HPA-3 and 15 system,high heterozygosity,it is worth noting that the HPA -2 gene.

Key words:HPA;genotype;PCR-SSP

基金項(xiàng)目：吉林省衛(wèi)生青年科研課題(2013Q016)、吉林省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(201015186)、吉林省衛(wèi)生自籌經(jīng)費(fèi)課題(2013ZC010)

文章編號：1007-4287(2016)05-0750-02

中圖分類號：R558

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

(收稿日期：2015-10-07)