淋巴瘤患者血漿中miR-21、miR-155、miR-210的表達及臨床意義

曹慧琴，韋　瑋

(延安大學附屬醫(yī)院 血液科，陜西 延安716000)

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淋巴瘤患者血漿中miR-21、miR-155、miR-210的表達及臨床意義

曹慧琴，韋瑋

(延安大學附屬醫(yī)院 血液科，陜西 延安716000)

摘要：目的探討miR-21、miR-155、miR-210的臨床表達意義及其與淋巴瘤病理特征的相關性。方法采用RT-PCR技術及免疫組化法測定60例行淋巴瘤患者血清中miR-21、miR-155、miR-210表達量及BCL-6蛋白水平，并對其與淋巴瘤病理特征相關性進行分析。結果與正常對照組相比，淋巴瘤患者miR-21、miR-155、miR-210表達量顯著提高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。經相關分析可知，miR-21、miR-155表達量與免疫分型、MYC基因、BCL-6蛋白有關，而miR-210表達量則與免疫分型、MYC基因有關。結論miR-21、miR-155、miR-210可能與淋巴瘤發(fā)生及進展相關。通過測定miR-21、miR-155、miR-210表達情況可有效預測淋巴瘤病情的進展，對臨床淋巴瘤診治具有重要的指導意義。

關鍵詞：miR-21；miR-155；miR-210；淋巴瘤；病理特征

(ChinJLabDiagn,2016,20:0764)

淋巴瘤是臨床常見的血液惡性腫瘤，患者臨床表現(xiàn)為淋巴組織形態(tài)學、免疫表型、細胞及分子遺傳學等方面的異質性[1]。微小RNA(miRNA)是近年新發(fā)現(xiàn)的內源性RNA，它不參與內源蛋白編碼，但能在轉錄后提高調節(jié)基因的表達水平[2]。miRNA是由19-24個核苷酸組成的非編碼蛋白質短小單鏈RNA家族，其可通過通過抑制靶mRNA翻譯或解除靶mRNA轉錄從而調控相關基因表達[3]。研究指出[4]，miRNA在生物生長發(fā)育、細胞凋亡、分化及腫瘤生成過程中起到重要的作用。與其中惡性腫瘤相比，淋巴瘤患者明顯存在miRNA表達失調的情況。目前已知的若干種miRNA參與淋巴瘤的發(fā)生及進展，其miRNA臨床表達與淋巴瘤分子亞型有密切的關系。本研究將應用熒光定量PCR技術測定淋巴瘤患者miR-21、miR-155、miR-210水平，并探討其于淋巴腫瘤病理特征的關系及其在臨床診斷及預后中的預測價值。

1資料與方法

1.1臨床資料

收集2011年6月至2013年6月本院行淋巴瘤手術60例患者的臨床資料，患者入組前均沒接受過放化療治療，其中男性35例，女性25例，年齡為48-74歲，平均年齡為(56.8±3.4)歲。TNM分期：Ⅰ期 28例，Ⅱ期22例，Ⅲ期 10例。病理組織分期均符合2008年WHO對臨床造血組織腫瘤分類標準，均經符合中國濾泡性淋巴瘤診斷與治療指南(2013年版)。患者均行單克隆抗體(單抗)聯(lián)合CHOP(環(huán)磷酰胺、阿霉素、長春新堿、潑尼松)方案免疫化療，由兩位資深病理專家對患者免疫表型進行分析及確診。另選取60例正常體檢者為對照組，男 32例，女28例，年齡45-75歲，平均年齡(54.8±3.6)歲，兩組性別、年齡無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學法測定淋巴瘤患者免疫分型

采用MYC基因雙色分離探針測定淋巴瘤患者MYC基因分型。采用Envision法標記患MUM-1、CD3、CD10、CD20、BCL-6，參照文獻對患者陽性表達結果進行評價。根據Hans分類法，依據MUM-1、CD10、BCL-6表達結果劃分GCB型及non-GCB型。若MUM-1、CD3、CD10、CD20、BCL-6均為陽性或當中有一項為陽性則為GCB型，MUM-1、CD3、CD10、CD20、BCL-6均為陰性則歸為non-GCB型。

1.2.2總RNA的提取(1)樣本獲取及處理：對入院擬診為淋巴瘤的患者留取血液標本，1小時內離心沉淀血細胞，取上層血清保存于-80℃冰箱待檢測。(2)血清樣品miRNA 表達譜分析的多重莖環(huán)RT-PCR技術建立：根據miRBase數(shù)據庫(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences)中miRNA序列，參照Tang F等提供的miRNA 表達譜分析方法(Tang F,Hajkova P,Barton SC,O'Carroll D,Lee C,Lao K,Surani MA.220-plex microRNA expression profile of a single cell.Nat Protoc.2006;1(3):1154-9.)，建立了血清miRNA 表達譜分析的多重莖環(huán)RT-PCR技術。(3)血清RNA抽提及逆轉錄：在血清標本中加入人工合成的已知濃度的miRNA作為實時定量RT-PCR標準品。按RNA抽提步驟用TRIzo LSl試劑(Invitrogen)抽提組織總RNA。

1.2.3miR-21、miR-155、miR-210表達分析根據相關文獻報道的miRNA檢測莖環(huán)RT-q PCR方法，以1et-7a miRNA作為內參基因，分析miR-21、miR-155、miR-210表達情況。選取淋巴瘤及配對組織進行miR-21、miR-155、miR-210表達水平檢測，設計反應引物。分別以miR-21、miR-155、miR-210及l(fā)et-7a頸環(huán)RT引物進行RNA逆轉錄，反應條件為：先在42℃中反向轉錄30 min,隨后將溫度變?yōu)?5℃將mRNA變性2 min，然后于55℃中15 s、72℃中30 s以及95℃中30 s反復循環(huán)擴增，并在退火階段收集熒光信號，并記錄每個反應管中熒光信號到達預設閾值時所經歷的循環(huán)數(shù)，并計算miR-21、miR-155、miR-210相對表達量。基因相對表達量=目的基因/內參基因。

1.4統(tǒng)計學分析

2結果

2.1淋巴瘤患者免疫組織化學法結果

60例淋巴瘤患者BCL-6陽性38例(63.33%)，陰性22例(36.67%)，見圖1，2。

圖1淋巴瘤細胞BCL-6呈陰性表達圖2淋巴瘤細胞BCL-6呈陽性表達

2.2淋巴瘤組織中miR-21、miR-155、miR-210表達情況分析

與正常胃粘膜組織相比，淋巴瘤組織中miR-21、miR-155、miR-210表達量顯著提高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

2.3miR-21、miR-155、miR-210表達與淋巴瘤臨床病理分析

經相關分析可知，miR-21、miR-155表達量與免疫分型、MYC基因、BCL-6蛋白有關，而miR-210表達量則與免疫分型、MYC基因有關，見表2。

表1　　　淋巴瘤組織中miR-21、miR-155、miR-210

表2　miR-21、miR-155、miR-210表達與淋巴瘤臨床病理分析

3討論

腫瘤發(fā)生發(fā)展機制異常復雜，涉及多種抑癌基因、癌基因及相應的信號傳導通路的改變。miRNA在細胞生成、分化、凋亡及腫瘤發(fā)生等多種生理及病理性過程中起到重要的作用。在腫瘤發(fā)生過程中miRNA表達對腫瘤病情診斷具有重要的意義。近年有研究指出[5]，某些特定miRNA測定對預測腫瘤患者病情進展及預后有重要的作用，可為臨床上治療方案制定提供強而有力的依據。

Lan等[6]指出與正常B細胞系相比，在原發(fā)性淋巴瘤系、濾泡中心淋巴瘤中miR-155呈高表達。與細胞系結果一致，在淋巴瘤患者中miR-155在患者表達水平較高。XX等[7]對176例淋巴瘤患者臨床資料進行分析，結果顯示，非GCB型淋巴瘤患者miR-155表達水平顯著升高。本研究通過應用RT-PCR測定60例淋巴瘤患者miR-155的表達情況，結果顯示，miR-155在淋巴瘤表達水平顯著高于正常淋巴組織B細胞，進一步經免疫分型發(fā)現(xiàn)，miR-155在non-GCB型中表達水平顯著高于GCB型，結果與既往研究相同。

MYC基因位于8q24編碼區(qū)，能編碼短半衰期的核磷蛋白，其位點多態(tài)性與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切的關系[8]。宋國齊等[9]研究指出，在5%-10%淋巴瘤患者中可檢測MYC基因重排，且MYC基因重排與淋巴瘤遠處轉移有關。此外，MYC基因重排患者遠期預后較差，且中樞神經系統(tǒng)并發(fā)癥高于未重排患者。朱明霞等[10]研究發(fā)現(xiàn)，miR-21及miR-155可促使MYC重排，從而影響淋巴腫瘤患者預后。本研究結果發(fā)現(xiàn)MYC基因重排的淋巴瘤患miR-21、miR-155、miR-210表達量顯著下降，研究證實了miR-21、miR-155高表達量可影響MYC基因重排，從而影響淋巴瘤患者的預后。

BCL-6基因編碼的蛋白是由706個氨基酸組成的，具有鋅指樣結構的核內轉錄抑制因子，可調節(jié)細胞分化、增殖及器官發(fā)育。BCL-6蛋白在正常情況僅在中心B細胞中表達，是調節(jié)細胞生長發(fā)育中的重要調控因子。BCL-6蛋白異常表達與惡性腫瘤的發(fā)生及病情進展有密切的關系[11]。Wan等[12]研究指出，BCL-6可抑制MYC基因重排，從而影響漿細胞分化、細胞周期凋亡、調控及DNA修復，當BCL-6正常下調被阻斷，則會導致細胞分化受阻、增殖受限、凋亡機制異常，從而引起細胞惡質變。本研究結果發(fā)現(xiàn)，BCL-6蛋白陰性組患者miR-21、miR-155表達量高于陽性組，從而提示淋巴瘤機體可通過調控miR-21、miR-155的表達而直接調節(jié)BCL-6蛋白，進而影響患者預后。

綜上所述，miR-21、miR-155、miR-210可能與淋巴瘤發(fā)生及進展相關。通過測定miR-21、miR-155、miR-210表達情況可有效預測淋巴瘤病情的進展，對臨床淋巴瘤診治具有重要的指導意義。

參考文獻：

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The expression and clinical significance of miR-21,miR-155,miR-210 of plasma lymphoma patients

CAOHui-Qin,WEIWei.

(YanAnUniversityAffiliatedHospital,YanAn716000,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of miR-21,miR-155,miR-210 of plasma lymphoma patients.MethodsThe expression levels of miR-21,miR-155,miR-210 and BCL-6 protein of 60 cases of plasma lymphoma patients were measured with RT-PCR and immunohistochemical staining,the features associated with lymphoma were analyzed.ResultsThe levels of miR-21,miR-155,miR-210 of plasma lymphoma patients were higher than control group(P<0.05).The expression of miR-21,miR-155 were relationship with immune typing,MYC gene,BCL-6 protein,whereas the expression of miR-210 were relationship with immune typing,MYC genes.ConclusionmiR-21,miR-155,miR-210 may occur and progress associated with lymphoma.By measuring miR-21,miR-155,miR-210 expression can predict disease progression of lymphoma,has important significance for clinical diagnosis and treatment of lymphoma.

Key words:miR-21;miR-155;miR-210;lymphoma;pathological features

文章編號：1007-4287(2016)05-0764-04

中圖分類號：R733.4

文獻標識碼：A

作者簡介：曹慧琴(1982-)，女，主治醫(yī)師，研究方向：淋巴瘤的臨床診斷治療。

(收稿日期：2015-05-14)