3'-大豆苷元磺酸鈉抗四氯化碳誘導(dǎo)的慢性肝損傷免疫機制探討*

魏桂林，曾雪亮，黎　曉，曾　靖

(贛南醫(yī)學(xué)院 1.第一附屬醫(yī)院;2.藥學(xué)院，江西　贛州　341000)

?

3'-大豆苷元磺酸鈉抗四氯化碳誘導(dǎo)的慢性肝損傷免疫機制探討*

魏桂林1，曾雪亮1，黎曉2，曾靖2

(贛南醫(yī)學(xué)院 1.第一附屬醫(yī)院;2.藥學(xué)院，江西贛州341000)

摘要：目的：觀察3'-大豆苷元磺酸鈉(DSS)對CCl4所致小鼠肝損傷的保護作用，并研究其對免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用。方法：以腹腔注射10% CCl4制作小鼠肝損傷模型。造模期間隨機分組，每組分別給予生理鹽水、聯(lián)苯雙酯、DSS灌胃治療，持續(xù)6周。檢測血清中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性及IL-2、TNF-α含量；流式細胞儀測定全血中T細胞亞群(CD3+、CD4+、CD8+)水平。結(jié)果：給予不同劑量DSS治療肝損傷模型小鼠后，小鼠血清ALT、AST及TNF-α水平均不同程度降低，IL-2水平升高，降低或升高的差異均以高劑量組更為顯著(P<0.05或P<0.01)；小鼠全血 CD3+、CD4+細胞比例降低， CD8+細胞比例提高， CD4+/CD8+T細胞比值降低。結(jié)論：DSS對CCl4誘導(dǎo)的慢性肝損傷有保護作用，其作用是通過平衡T淋巴細胞亞群，調(diào)節(jié)免疫功能實現(xiàn)的。

關(guān)鍵詞：3′-大豆苷元磺酸鈉；肝損傷；T淋巴細胞亞群；白介素-2

肝臟是人體最大的代謝和解毒器官，其功能障礙直接影響人體健康，甚至危及生命。生化、藥物、病毒等多種因素可導(dǎo)致肝損傷。3'-大豆苷元磺酸鈉(3'-daidzein sulfonate sodium，DSS) 是葛根有效成分大豆苷元結(jié)構(gòu)修飾后的產(chǎn)物，具有強水溶性，體內(nèi)代謝后發(fā)揮與大豆苷元相似的藥理活性。DSS具有抗氧化[1-2]、增強氧自由基清除[3]、抑制炎癥[4]、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[5-6]、調(diào)節(jié)骨代謝[7]等藥理作用。本實驗通過CCl4誘導(dǎo)小鼠慢性肝損傷模型，考察DSS對化學(xué)肝損傷的保護作用，并研究T淋巴細胞亞群在其中的作用。

1材料

1.1動物SPF級昆明種小鼠，雄性，體重20～25 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK(湘)2011-003，合格證號：No.4304701590。

1.2藥物與試劑3'-大豆苷元磺酸鈉(由沈陽藥科大學(xué)天然藥物化學(xué)試驗室提供，純度99.9%)，以0.9%NaCl溶液配成所需濃度；聯(lián)苯雙酯滴丸(北京協(xié)和藥廠，批號：11110104)，搗碎以0.9%NaCl溶液配成所需濃度；四氯化碳(分析純，江西洪都試劑化工廠，批號：20120715)，臨用前與植物油混合配成10%的CCl4植物油溶液；天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)及丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)檢測試劑盒(購自南京建成生物工程研究所，批號分別為：20130712、20130907)；IL-2及TNF-α ELISA檢測試劑盒(購自武漢博士德生物工程有限公司，批號分別分為：EK 0387、EK 0583)；葉綠素蛋白(PerCP)標(biāo)記的抗小鼠CD3e抗體(貨號：553067)、藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的抗小鼠CD8a抗體(貨號：553032)、別藻青蛋白(APC)標(biāo)記的抗小鼠CD4抗體(貨號：553051)均購自BD公司。

1.3儀器BD FACS Calibur 流式細胞儀(美國BD公司)；日本日立7600-020全自動生化分析儀(日本日立公司)；多功能酶標(biāo)儀(美國伯樂公司)MIKRO22R臺式冷凍離心機(德國Hettich)；BS224S電子天平(北京賽多利斯)。

2方法

2.1小鼠肝損傷模型建立與給藥昆明種小鼠(20～25 g)按照隨機數(shù)字表法分成6組，分別為正常組、模型組、陽性藥物對照組、低劑量DSS組、高劑量DSS組。參考文獻[8]的方法制作小鼠慢性肝損傷模型：除正常組外均腹腔注射10%CCl4油溶液(0. 01 mL· g-1)，每周2次，持續(xù)6周。各給藥組相應(yīng)灌胃給予聯(lián)苯雙酯(2.5 mg·kg-1)、DSS(低劑量：0.1 mg·kg-1；高劑量：0.3 mg·kg-1)，正常和對照組給予等體積0.9%NaCl溶液(0.01 mL·g-1)，持續(xù)6周。小鼠末次給藥，不禁水，禁食12 h后，摘眼球取血，一部分血低溫離心(3 000 r·min-1，10 min，4 ℃)獲得血清，于-80 ℃凍存?zhèn)溆?。一部分血置于抗凝管中獲得抗凝血，用于T淋巴細胞亞群檢測。

2.2肝功能生化檢測按試劑盒說明的操作，用全自動生化分析儀檢測血清ALT和AST活性。

2.3細胞因子檢測按酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒說明操作，檢測小鼠血清中IL-2及TNF-α的水平。

2.4T淋巴細胞亞群比例檢測取抗凝血20 μL，加入180 μL紅細胞裂解液，混勻后靜置10 min，加入2 mL PBS，離心(600×g，5 min)，棄上清，加100 μL PBS重懸白細胞，并加入CD3+、CD4+和CD8+混合抗體(2∶1∶1)8 μL，避光孵育15 min，上機檢測，收集數(shù)據(jù)，Cellqeust軟件分析CD3+、CD4+、CD8+陽性細胞比例，并計算CD4+/CD8+陽性細胞的比值。

3結(jié)果

3.1DSS對肝損傷小鼠血清ALT、AST的影響由表1可知，模型組小鼠血清ALT及AST活性較正常組均升高，提示CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷模型制作成功；DSS各劑量給藥組與模型組比較，血清ALT及AST活性均顯著降低(P<0.05或P<0.01)，其中高劑量DSS對肝酶的影響更為顯著；給藥組與陽性藥物組相比ALT及AST的變化無顯著性差異。結(jié)果說明DSS能顯著降低CCl4所致肝損傷小鼠血清ALT、AST活性，且呈一定的劑量依賴性。

表1　小鼠血清ALT、AST的檢測結(jié)果

注：與正常組相比,**P<0.01；

與模型組相比#P<0.05, ##P<0.01。

3.2DSS對肝損傷小鼠免疫相關(guān)細胞因子的影響由表2可知,與正常組比較，模型組小鼠血清中免疫細胞分泌的細胞因子IL-2的含量顯著降低(P<0.01)，TNF-α的含量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，DSS治療后，小鼠血清中IL-2的含量升高(P<0.05或P<0.01)，TNF-α的含量下降(P<0.05或P<0.01)，其中高劑量組的變化更為顯著。結(jié)果說明，DSS對肝損傷小鼠免疫相關(guān)的細胞因子具有調(diào)節(jié)作用。

3.3DSS對肝損傷小鼠肝臟T淋巴細胞亞群的影響由表3、圖1可知，模型組小鼠外周血CD3+淋巴細胞數(shù)升高(P<0.01)，CD4+T淋巴細胞比例增高，CD8+T細胞比例降低(P<0.05)，CD4+/CD8+T淋巴細胞比值升高(P<0.05)；與模型組比較，DSS治療后，CD3+細胞比例降低(P<0.05或P<0.01)，CD8+T 淋巴細胞比例升高(P<0.01)，CD4+/CD8+T淋巴細胞比值降低(P<0.05或P<0.01)，CD4+T淋巴細胞比例降低，其中高劑量DSS對T淋巴細胞亞群的影響更為顯著。結(jié)果說明DSS對T淋巴細胞亞群具有調(diào)節(jié)作用。

表2　小鼠血清細胞因子IL-2和TNF-α的變化情況

注：與正常組相比**P<0.01；與模型組相比 #P<0.05, ##P<0.01。

表3　小鼠全血T淋巴細胞亞群比例檢測結(jié)果±s，n=8

注：與對照組相比*P<0.05,**P<0.01；與模型組相比 #P<0.05, ##P<0.01。

A:對照組；B:模型組；C：陽性藥物組；D:DSS組低劑量;E:DSS高劑量組

4討論

CCl4致肝損傷動物模型是研究護肝藥最常用的模型。CCl4在肝微粒體細胞色素P450代謝生成氧自由基，這些自由基會破壞細胞膜結(jié)構(gòu)，增加膜通透性，導(dǎo)致肝酶外漏，故檢測血清肝酶水平能夠反映肝細胞損傷程度。ALT和AST是臨床檢測肝功能的重要肝酶指標(biāo)，兩者血清含量的變化可直觀評判肝功能情況[9]。本研究CCl4誘導(dǎo)的肝損傷模型小鼠血清ALT和AST活性顯著增高，說明模型小鼠發(fā)生了肝損傷。給予DSS治療后，模型小鼠血清ALT和AST活性顯著降低，且這一作用與聯(lián)苯雙酯無差異，結(jié)果提示，DSS能夠?qū)笴Cl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷。

IL-2和TNF-α是免疫細胞分泌的主要細胞因子，介質(zhì)了機體的免疫應(yīng)答反應(yīng)，有研究表明[10]，IL-2和TNF-α等由免疫細胞分泌的因子介導(dǎo)了肝臟炎性壞死、纖維化等損傷過程，其中IL-2水平與肝損害呈負相關(guān)，TNF-α水平與肝損害呈正相關(guān)。IL-2是由活化的CD4+T細胞和CD8+T細胞產(chǎn)生，具有促進T細胞增殖、增強殺傷T細胞、NK細胞的免疫調(diào)節(jié)活性，是一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子。血清中IL-2水平的下降能夠說明機體免疫低下[11]。TNF-α是由單核巨噬細胞分泌的細胞因子，是炎癥機制的關(guān)鍵介質(zhì)，高水平的TNF-α介導(dǎo)了氧自由基等多種途徑的肝細胞損傷過程。檢測血清中的IL-2和TNF-α水平的變化能夠反應(yīng)機體免疫應(yīng)答的變化。本研究結(jié)果顯示，DSS能夠調(diào)節(jié)CCl4誘導(dǎo)的肝損傷小鼠血清中免疫相關(guān)因子IL-2和TNF-α，升高IL-2水平增強免疫，降低TNF-α水平減少肝細胞損傷。

T細胞亞群是淋巴細胞的一種，是機體免疫應(yīng)答功能的重要細胞成分。成熟的T淋巴細胞表面均可表達CD3分子，CD3+T細胞的絕對數(shù)量能夠代表T淋巴細胞的總體數(shù)量，能夠反映機體的免疫狀態(tài)。CD3+T細胞增高可發(fā)生超敏反應(yīng)，過低免疫功能低下，易引發(fā)感染。CD3+T細胞的數(shù)量保持在一定范圍內(nèi)是機體維持正常的要素。本研究CCl4誘導(dǎo)的肝損傷模型小鼠外周血CD3+T細胞比例顯著增高，說明模型小鼠處于過激的細胞免疫調(diào)節(jié)狀態(tài)，會通過多種淋巴因子誘導(dǎo)炎癥因子加重炎癥而損傷肝細胞[12]。本實驗結(jié)果顯示，DSS治療后，慢性肝損傷小鼠外周血CD3+T細胞比例顯著降低，這說明DSS能夠減少T淋巴細胞的總數(shù)量，避免機體過于激烈的細胞免疫導(dǎo)致的肝細胞損傷。

T淋巴細胞按照其功能和表面標(biāo)志可以分成若干亞群，包括輔助性T細胞(Th)、抑制性T細胞(Ts)、效應(yīng)T細胞(Te)、細胞毒性T細胞(Tc)。Th細胞表面表達CD4，故又被稱為CD4+細胞，其功能在于協(xié)助T、B淋巴細胞、產(chǎn)生免疫應(yīng)答等。Ts細胞和Tc細胞表面表達CD8，故又名CD8+細胞，其功能是抑制B細胞合成和分泌抗體、遲發(fā)型超敏反應(yīng)等。機體正常情況下CD4+細胞和CD8+細胞比值維持動態(tài)平衡，CD4+/CD8+比值能夠反映機體免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)能力。本實驗CCl4誘導(dǎo)的肝損傷模型小鼠外周血中CD4+水平略有升高，CD8+T細胞的百分比降低，CD4+/CD8+比值升高，這一結(jié)果與吳濤等針對慢性乙肝患者的研究結(jié)果一致[13]，說明模型小鼠被成功誘導(dǎo)為慢性肝損傷。慢性肝損傷小鼠給予DSS治療后，外周血CD8+細胞比例顯著升高，CD4+細胞比例略有下降，CD4+/CD8+比值顯著降低，且這一變化后的比例均趨向于正常水平，說明DSS能夠改善慢性肝損傷T淋巴細胞亞群紊亂，調(diào)節(jié)機體免疫應(yīng)答。

綜上所述，DSS對CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷有治療作用，其作用機制與調(diào)節(jié)小鼠肝臟T淋巴細胞亞群，升高IL-2、降低TNF-α等免疫介質(zhì)有關(guān)。

參考文獻:

[1]李良東, 黃志華, 曾靖,等. DSS對腦缺血再灌注損傷的保護與抗氧化作用的關(guān)系[J]. 中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志,2009(4):407-409.

[2]黃志華, 李良東, 肖海, 等.3'-大豆苷元磺酸鈉對心肌缺血/再灌注損傷及抗氧化作用的影響[J].中國藥理學(xué)通報，2009，25(4):481-483.

[3]鐘星明, 曾靖, 黃志華, 等.3'-大豆苷元磺酸鈉對大鼠腦缺血/再灌注損傷的保護作用[J].時珍國醫(yī)國藥，2011(1):31-33.

[4]鐘聲, 曾靖, 李良東，等.3′-大豆苷元磺酸鈉對大鼠腦缺血/再灌注損傷時IL-6的影響[J].時珍國醫(yī)國藥，2011(2):292-293.

[5]黎曉, 劉宗亮, 陳方，等.DSS對去卵巢大鼠脂代謝及血清瘦素的影響[J].贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2013，33(4):481-484.

[6]曾靖, 黃玉萍, 黃玉珊, 等.3'-大豆苷元磺酸鈉對氧化低密度脂蛋白致內(nèi)皮細胞損傷的保護作用研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2009，20(9):2151-2153.

[7]羅曉冰, 卑占宇, 王文寶, 等.3'-大豆苷元磺酸鈉對去卵巢大鼠骨代謝的影響[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2013(9):1119-1121.

[8]Ghasemi M, Azarnia M, Jamali M, et al.Protective effects of Ephedra pachyclada extract on mouse models of carbon tetrachloride-induced chronic and acute liver failure[J].Tissue Cell，2014，46(1):78-85.

[9]Xie C, Li L, Xu YP, et al.Anti-fibrosis effects of fenofibrate in mice with hepatic fibrosis[J]. Chinese journal of hepatology，2013，21(12):914-919.

[10] kker Z, Walubo A, du Plessis JB.The role of the immune system in nevirapine-induced subclinical liver injury of a rat model[J].ISRN Pharm，2012，2012:932542.

[11]Sharma M, Mohapatra J, Malik U, et al. Selective inhibition of tumor necrosis factor-α converting enzyme attenuates liver toxicity in a murine model of concanavalin A induced auto-immune hepatitis[J]. Int Immunopharmacol，2013，17(2):229-36.

[12]丁巧云,俞海英,孫薇薇,等.重型肝炎外周血T淋巴細胞亞群變化[J].江蘇醫(yī)藥，2010(19):2336-2337.

[13]吳濤,蔡篤運,林鋒,等.慢性乙型肝炎和重型肝炎患者外周血T淋巴細胞亞群與HBV-DNA、HBeAg的關(guān)系[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2012(17):4517-4519.

Immunologic Mechanism of 3'-daidzein Sulfonate Sodium in Treatment of Liver Injury Induced by CCl4

WEIGui-lin1,ZENGXue-liang1,LIXiao2,ZENGJing2

(1.TheFirstAffiliatedHospitalofGannanMedicalUniversity;2.SchoolofPharmacy,GannanMedicalUniversity,Ganzhou,Jiangxi341000)

Abstract:Objective:To explore the protective effects of 3'-daidzein sulfonate sodium (DSS) on chronic liver injury induced by carbon tetrachloride(CCl4) in mice and to appraise the role of T lymphocyte subsets.Methods: 10% CCl4 was injected in mice by intraperitoneal injection to make liver injury model. At the same time, the mice were divided into different groups and were treated with normal saline, bifendate and DSS respectively for six weeks, once a day. The activity of AST and ALT, and the level of IL-2 and TNF-α in serum were detected. The T lymphocyte subsets(CD3+、CD4+、CD8+) in blood were observed by using Flow cytometry. Results:Compared with the model group, DSS treated groups showed decrease in the activities of ALT and AST, and the level of TNF-α, and an increase in IL-2 level. After treated with DSS, the ratio of CD3+、CD4+、CD4+/CD8+ were reduced, while CD8+ cell were elevated. Conclusion:DSS plays a protective role in chronic hepatic injury induced by CCl4 and it is the result of DSS modulating the immunologic function by counterbalance the T lymphocyte subsets.

Key words:3'-daidzein sulfonate sodium; liver injury;T lymphocyte subsets; IL-2

*基金項目:國家自然科學(xué)基金項目(NO.81160399)；江西省衛(wèi)生廳科技項目(NO.20133107)；贛南醫(yī)學(xué)院科技項目(NO.YB201117)

通訊作者:曾靖，男，教授，碩士研究生導(dǎo)師，從事心腦血管藥理研究。E-mail: zengjing61@hotmail.com

中圖分類號：R285.5

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-5779(2016)02-0172-04

DOI:10.3969/j.issn.1001-5779.2016.02.002

(收稿日期：2015-11-30)(責(zé)任編輯：敖慧斌)