贛南黃花倒水蓮水提取物體外清除超氧陰離子活性的實驗研究*

李洪亮,程齊來,劉　濤,范小娜

(贛南醫(yī)學院,江西　贛州　341000)

?

贛南黃花倒水蓮水提取物體外清除超氧陰離子活性的實驗研究*

李洪亮,程齊來,劉濤,范小娜

(贛南醫(yī)學院,江西贛州341000)

摘要：目的：評價黃花倒水蓮水提取物體外清除超氧陰離子能力，探討黃花倒水蓮水提取物降低超氧陰離子對細胞DNA的損傷。方法：基于鄰苯三酚在堿性條件下不穩(wěn)定，自氧化產(chǎn)生(O2.-)，O2.-與化學發(fā)光劑魯米諾(Luminol)反應使之氧化，產(chǎn)生一個電子激發(fā)態(tài)的中間體，退激時發(fā)光的原理，檢測黃花倒水蓮水提取物體外清除超氧陰離子的能力。結(jié)果：在黃花倒水蓮水提取物的原濃度(3 000.000 mg·mL-1)時，超氧陰離子被清除了90.451%，隨著黃花倒水蓮水提取物溶液的稀釋，其清除超氧陰離子的能力逐漸降低，當稀釋為原濃度的1/128(23.438 mg·mL-1)時，黃花倒水蓮水提取物溶液清除超氧陰離子的能力與空白組比較接近。結(jié)論：黃花倒水蓮水提取物具有良好的體外清除超氧陰離子活性的能力，隨著黃花倒水蓮水提取物溶液的稀釋，其清除超氧陰離子的能力逐漸降低。

關(guān)鍵詞：黃花倒水蓮水提取物；超氧陰離子；鄰苯三酚

超氧陰離子在人體內(nèi)有一定數(shù)量的存在，不發(fā)生化學變化對人體無害，但與羥基(-OH)結(jié)合后的產(chǎn)物會導致細胞DNA損壞，破壞人類機體功能[1]。消除超氧陰離子的方法，目前揮發(fā)油抑制超氧陰離子的產(chǎn)生并清除其活性，可降低超氧陰離子對細胞DNA的損傷，黃花倒水蓮(PolygalafallaxHemsl,PFH)又稱假黃花遠志，主產(chǎn)于湖南、廣西、江西、廣東和云南等地，藥用其全草。味甘、微苦、性平、具有補益、強壯、祛濕、散癖功效，主治虛弱虛腫、急慢性肝炎、腰腿酸痛、跌打損傷[2]。隨著現(xiàn)代社會生活節(jié)奏的加快，人們承受社會、心理、工作的壓力越來越大，導致胃黏膜疾病的發(fā)生率相應增高。中醫(yī)臨床研究發(fā)現(xiàn)，在胃黏膜疾病患者中有脾胃虛弱證者占相當?shù)谋戎兀菊n題組研究發(fā)現(xiàn)黃花倒水蓮和六月雪二味中藥煎劑是以疏肝健脾為法，以民間二味中藥復方煎劑治療上消化道出血為依據(jù)，對治療腹瀉型腸易激綜合征具有明顯的效果，對小鼠胃黏膜損傷有明顯的保護作用，因此我們針對黃花倒水蓮水提取物體外抗超氧陰離子活性，探討黃花倒水蓮水提取物降低超氧陰離子對細胞DNA的損傷，現(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1.1儀器與試劑BPCL-1-G-C微弱發(fā)光測量儀 (中國科學院北京生物物理研究所)；鄰苯三酚(江西洪都化學制劑廠)；3-氨基鄰苯二甲酰肼(luminol)(Sigma公司)；乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)(上海化學試劑總廠)； 其他試劑均為分析純。

1.2樣品溶液的制備取干燥六月雪1 500 g,加雙蒸水過液面2 cm,煮沸2次，30 min·次-1，合并濾液，濃縮至400 mL加3倍量的95%乙醇，放冰箱靜置過夜，次日減壓過濾，并回收濾液中乙醇，繼續(xù)濃縮濾液得無醇味的提取物。提取物加雙蒸水至500 mL使藥液為相當于生藥復方3 g·mL-1，用0.5%NaOH調(diào)整pH為7.0置冰箱中備用。

1.3清除超氧陰離子(O2.-)實驗

1.3.1試液配制本實驗采用鄰苯三酚-魯米諾-碳酸緩沖液(pH 10.2)體系，鄰苯三酚溶液：0.126 g鄰苯三酚加入7.74 mg EDTA，加1 mmol·L-1HCl水溶液溶解，定容到100 mL，4 ℃保存，臨用前用蒸餾水稀釋10倍。碳酸緩沖液(pH 10.2)：0.1 mol·L-1碳酸鈉水溶液210 mL和0.1 mol·L-1碳酸氫鈉水溶液90 mL混合，加入111.6 mg EDTA，溶解，調(diào)至pH=10.2即得。魯米諾溶液：17.7 mg魯米諾加入0.1 mol·L-1碳酸鈉水溶液定溶到100 mL，4 ℃保存，臨用前與碳酸緩沖液(pH 10.2)以(1∶2)混勻。

1.3.2超氧陰離子的產(chǎn)生與清除實驗原理及方法鄰苯三酚在堿性條件下不穩(wěn)定，自氧化產(chǎn)生(O2.-)，O2.-與化學發(fā)光劑魯米諾(Luminol)反應使之氧化，產(chǎn)生一個電子激發(fā)態(tài)的中間體，退激時發(fā)光。抗氧化劑可以清除O2.-，抗氧化劑與O2.-反應的原理是使O2.-質(zhì)子化，從而使O2.-被還原，因此可以減少激發(fā)態(tài)魯米諾的產(chǎn)生，所以發(fā)光強度降低。操作步驟為：在發(fā)光杯中加入10 μL黃花倒水蓮水提取物溶液(以相同量的蒸餾水作空白對照)和20 μL鄰苯三酚溶液，再加入魯米諾-碳酸緩沖液(1∶2)混合溶液970 μL啟動反應，記錄發(fā)光強度(Chemical Luminescence，CL)。CL值以峰高計算，根據(jù)CL大小可以判斷物質(zhì)清除自由基的能力。自由基清除率用以下公式計算。

自由基清除率=(CL空白對照-CL樣品)/CL空白對照×100%

鄰苯三酚-魯米諾-碳酸緩沖液(pH 10.2)發(fā)光體系的動力曲線見圖1。從該動力曲線圖可見，反應在啟動后，將在200秒鐘之內(nèi)出現(xiàn)最高峰，在300秒之后發(fā)光基本結(jié)束。

圖1　鄰苯三酚-魯米諾-碳酸緩沖液(pH 10.2)體系動態(tài)曲線

該體系的工作原理如下：

①鄰苯三酚在堿性環(huán)境下自氧化產(chǎn)生超氧陰離子(O2.-)。

②超氧陰離子(O2.-)奪取還原劑的一個氫而被還原。

③剩余的超氧陰離子(O2.-)將魯米諾氧化為電子激發(fā)態(tài)，退激發(fā)時釋放一個光子。

以高濃度逐漸稀釋的方式檢測不同濃度黃花倒水蓮水提取物對CL的影響，每個濃度黃花倒水蓮水提取物都做相應的空白對照。根據(jù)以上公式計算對自由基的清除率，建立量效關(guān)系曲線，通過量效曲線求算出發(fā)光抑制率為50%時黃花倒水蓮水提取物的濃度(IC50)值，IC50值反映了黃花倒水蓮水提取物對自由基的清除能力。IC50值越小，表明黃花倒水蓮水提取物清除自由基的能力越強。

2結(jié)果

根據(jù)表1的結(jié)果計算，黃花倒水蓮水提取物對超氧陰離子的IC50=444.113 mg·mL-1。由抑制曲線圖(圖2)可以看到，在黃花倒水蓮水提取物的原濃度(3 000.000 mg·mL-1)時，超氧陰離子被清除了90.451%，隨著黃花倒水蓮水提取物的稀釋，其清除超氧陰離子的能力逐漸降低，當稀釋為原濃度的1/128(23.438 mg·mL-1)時，黃花倒水蓮水提取物清除超氧陰離子的能力與空白組比較接近。各曲線達峰時間基本相同，說明黃花倒水蓮水提取物對超氧陰離子的產(chǎn)生并沒有明顯影響，主要的作用環(huán)節(jié)為清除已生成的超氧陰離子。

表1　黃花倒水蓮水提取物對超氧陰離子的抑制率

圖2　黃花倒水蓮水提取物對超氧陰離子體系動態(tài)曲線

3討論

血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)產(chǎn)生超氧陰離子，超氧陰離子自由基O2·-是生物體內(nèi)一類重要的氧自由基，可以經(jīng)過一系列反應生成其它自由基，從而引發(fā)一系列疾病比如：應激性胃炎、應激性結(jié)腸炎都與自由基對組織的破壞有關(guān)，及時清除過剩的O2.-具有重要意義，天然SOD目前認為是最好的抗氧化物質(zhì)，但普遍存在穩(wěn)定性差，分子量大，不容易透過細胞膜，且有免疫原性等缺點，使其應用受到限制[3]。因此尋找天然的抗氧化藥物是目前的研究熱點，有學者伺機從動物體內(nèi)獲得天然的抗氧化藥物，采用堿性蛋白酶酶解鰈魚魚皮膠原蛋白制備膠原蛋白肽，對其清除超氧陰離子自由基的能力進行研究，發(fā)現(xiàn)膠原蛋白肽有良好的清除超氧陰離子自由基的能力[4-5]，有研究認為中藥薏苡仁飲料的抗氧化活性，通過測定飲料清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基和超氧陰離子自由基(O2.-)的能力對薏苡仁飲料的抗氧化能力進行評價，發(fā)現(xiàn)薏苡仁飲料中的抗氧化物質(zhì)具有一定的抗氧化活性[6]，還有研究認為石榴皮鞣質(zhì)對羥自由基和超氧陰離子自由基均具有較好的清除作用，較低濃度時即可發(fā)揮清除作用[7]。

有學者對廣西黃花倒水蓮的抗氧化活性及有效部位進行研究，分離得到7個化學性質(zhì)不同的組分用比色法研究了各組分還原三價鐵離子及清除脂性自由基DPPH能力，采用化學發(fā)光法觀察各組分清除羥自由基和超氧陰離子的活性，發(fā)現(xiàn)廣西黃花倒水蓮各組分均有一定的清除自由基作用，這可以用來解釋其在傳統(tǒng)應用中的抗炎、抗衰老作用。最近本課題組對贛南中草藥進行大面積普查，同時對贛南黃花倒水蓮開花周期，以及生長環(huán)境進行摸查，發(fā)現(xiàn)贛南黃花倒水蓮資源短缺，并且由于大量采摘導致花粉受精周期延長，為了充分利用資源，本課題組對贛南黃花倒水蓮藥理作用進行梳理，黃花倒水蓮水提物對乙醇損傷的人胃黏膜上皮細胞具有保護作用，為探討其具體機制我們利用黃花倒水蓮水提取物對超氧陰離子的抑制作用，降低超氧陰離子對細胞DNA的損傷，實驗結(jié)果可以看到，在黃花倒水蓮水提取物的原濃度(3 000.000 mg·mL-1)時，超氧陰離子被清除了90.451%，隨著黃花倒水蓮水提取物的稀釋，其清除超氧陰離子的能力逐漸降低，

當稀釋為原濃度的1/128(23.438 mg·mL-1)時，黃花倒水蓮水提取物清除超氧陰離子的能力與空白組比較接近。各曲線達峰時間基本相同，說明黃花倒水蓮水提取物對超氧陰離子的產(chǎn)生并沒有明顯影響，主要的作用環(huán)節(jié)為清除已生成的超氧陰離子，實驗結(jié)果表明贛南黃花倒水蓮水提取物也具有良好的抗氧化活性，但其抗氧化活性與其對胃黏膜損傷的保護是否有一定的聯(lián)系還需要大量的實驗證明。

參考文獻：

[1]何秀英，吳紀梅，嚴振寰．鄰甲氧基苯甲醛丙氨酸席夫堿及其金屬配合物的合成、表征和對O2自由基的抑制作用[J].無機化學學報，1995(3)：302.

[2]王群，鄭海濤，葛堯，等．酶法制備鰈魚魚皮膠原蛋白肽及其清除超氧陰離子自由基的研究[J].中國農(nóng)學通報，2011,27(14)：302.

[3]陳健，黃媛恒，王乃平，等．玉郎傘多糖和皂苷對氧自由基清除作用研究[J].中藥藥理與臨床，2007，5(5)：100-102.

[4]盤賽昆，顧小紅，湯堅，等．鳙魚肉酶解物清除羥自由基的研究[J].食品與機械，2009，25(4)：65-67.

[5]袁曉晴，戴志遠，葉婧．響應面法優(yōu)化鳙魚魚肉蛋白的酶解工藝[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2010，38(21)：11499-11502.

[6]杜云建，趙玉巧，李念念．酶解法制備草魚魚鱗多肽及其清除羥自由基的研究[J]. 食品科學，2010，31(7)：168-172.

[7]侯付景，金春華，董明敏，等．響應面分析法優(yōu)化海地瓜酶解工藝及其抗氧化活性的研究[J].營養(yǎng)學報，2010，32(3)：276-280.

Experimental Study on Scavenging Superoxide Anion Activity of Water Extract of Polygala Fallax Hemsl in Vitro

LIHong-liang,CHENQi-lai,LIUTao,FANXiao-na

(GannanMedicalUniversity,Ganzhou,Jiangxi341000)

Abstract:Objective: To evaluate the ability of Polygala fallax Hemsl water extract to scaveng superoxide anion in vitro; to explore the damage of Polygala fallax Hemsl water extract by lowering superoxide anion on cell DNA. Methods: Based on the principle that when in alkaline condition pyrogallol is not stable,, the self-oxidation produces (O2.-), O2.-and chemical Luminol (Luminol) of oxidation reaction, and to produce an electronic excited state of intermediatesand luminous deexcitation , the ability of Polygala fallax Hemslwater extract used to remove superoxide anion in vitro was detected. Results: In the Polygala fallax Hemsl water extract of the original concentration (3 000.000 mg·mL-1), the ultra oxygen anion was removed by 90.451%. With the dilution of the water extract its ability to remove the ultra oxygen anion reduced gradually. when diluted to 1/128 of the original concentration (23.438 mg·mL-1), the ability of Polygala fallax Hemsl water extract solution to remove the ultra oxygen anion was closed to the blank group. Conclusion: Polygala fallax Hemsl water extract has a good ability to remove super oxide anion activity in vitro. With the dilution of Polygala fallax Hemsl water extract solution, its ability to remove superoxide anion decreases gradually.

Key word:Polygala fallax Hemsl water extract;superoxide anion;pyrogallic acid

*基金項目：江西省自然科學基金項目(20132BAB205078)；江西省教育廳科技項目(GJJ13680)

通訊作者：范小娜，女，教授，碩士生導師，主要從事中草藥活性成分篩選及新藥研發(fā)。E-mail:fxn918@126.com

中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：A

文章編號：1001-5779(2016)02-0176-04

DOI:10.3969/j.issn.1001-5779.2016.02.003

(收稿日期：2015-10-22)(責任編輯：敖慧斌)