人胎盤源間充質干細胞的分離、培養及生物學鑒定*

賴　平，陳懿建，羅耀玲，張敏鴻，楊建瓊，邱悅群

(贛南醫學院 1.2014級研究生；2.第一附屬醫院 a.血液科；b.臨床科研中心，江西　贛州　341000)

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人胎盤源間充質干細胞的分離、培養及生物學鑒定*

賴平1，陳懿建2a，羅耀玲2b，張敏鴻2b，楊建瓊2b，邱悅群2

(贛南醫學院 1.2014級研究生；2.第一附屬醫院 a.血液科；b.臨床科研中心，江西贛州341000)

摘要:目的:探討機械剪碎組織加酶液消化法分離、培養人胎盤間充質干細胞的可行性，并對間充質干細胞進行生物學鑒定。方法:取足月產人胎盤，采用機械剪碎組織加酶液消化法分離，密度梯度離心法提純胎盤組織中的細胞，利用細胞生長特性對細胞進行進一步分離、純化并傳代培養，倒置顯微鏡觀察細胞形態，流式細胞術鑒定細胞表面標記。結果:在倒置顯微鏡下，細胞為貼壁生長，形態呈長梭形，少數為多角形，胎盤組織來源間充質干細胞在體外可穩定長期傳代培養，應用流式細胞儀檢測結果顯示CD73、CD90、CD105 表達陽性， CD34、CD45、HLA-DR 表達陰性。結論:聯合利用機械剪碎胎盤組織和酶消化法可高效獲取胎盤間充質干細胞，獲取的胎盤間充質干細胞在體外培養過程中生長穩定，增殖能力強，可長期傳代或凍存。

關鍵詞：人胎盤間充質干細胞；機械剪碎；酶消化；干細胞培養

間充質干細胞在一定的條件下可以被誘導分化為多種類型的組織細胞，一直被認為是極佳的進行科學研究和醫用資源[1]。干細胞可通過骨髓、脂肪組織、臍帶血等途徑獲取。以往的獲取途徑因受到道德及倫理的限制不能廣泛開展。雖來源廣泛，不同來源的干細胞獲取、分離、純化困難也大大限制了其應用。胎盤中有大量的滋養細胞及豐富的胚外中胚層的間充質和血管[2]，從中獲取的干細胞可以很好的解決干細胞缺乏的現狀。胎盤是醫療廢物，分娩結束后對胎兒及產婦無影響，不受道德約束，并且含有豐富的干細胞。本研究擬采用機械剪碎組織加酶液消化法從胎盤絨毛層獲取間充質干細胞，并且用淋巴細胞分離液及間充質干細胞貼壁生長的特性進一步純化細胞，從而進一步觀察其生物學特性，與以往獲取方法相比具有簡單、高效、獲取細胞數量多等特點，為以后的研究奠定一定的基礎。

1材料及方法

1.1主要材料及儀器足月順產胎兒胎盤來自贛南醫學院第一附屬醫院婦產科，遵守相關醫學倫理學規定并經家屬同意獲得,母血經傳染病檢測均為陰性。淋巴細胞分離液(Ficoll),Ⅱ型膠原酶，低糖DMEM(Gibco公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，細胞培養箱(Thermo 公司，型號Forma 311)，倒置顯微鏡(Olympus 公司，型號 CKX 41)，超凈工作臺(上海博迅公司，型號 SW-CJ-2FD),低速離心機(江蘇環宇公司，型號80-2型)，高精度恒溫水浴箱(上海博迅公司，型號 SSW-600-2S)。

1.2胎盤間充質干細胞的分離及培養細胞分離純化于不同的時間段重復三次，由相同的實驗人員在超凈臺中進行，具體操作如下：取保持無菌狀態的新鮮足月順產胎兒胎盤一個，胎兒面朝向手心，母體面朝上，減去上層厚約2～3 mm的母體面。獲取深部呈網狀的胎盤組織約50 g置于無菌的培養皿中[3],用生理鹽水反復沖洗至無血跡，用已消毒處理的剪刀將組織盡可能剪碎，呈肉糜狀(以能用吸管吸取為標準)，轉移至15 mL的離心管中，按體積比約1∶6加入Ⅱ型膠原酶(0.1%)[4]，置于37 ℃恒溫水浴箱中消化30 min,間隔5 min適當混勻組織與消化液。多層紗布過濾取濾液，置于離心管中， 1 000 r·min-1，常溫下離心5 min，棄上清，用PBS約5 mL重懸細胞。將細胞懸液緩慢加至已配好的淋巴細胞分離液中。1 500 r·min-1,4 ℃離心20 min，離心后可見“白膜層”[5]，小心吸取該區域細胞，并加入4倍于該體積的PBS稀釋，1 000 r·min-1，常溫下離心5 min。重復一次，棄上清，用6 mL完全培養基(含10%的胎牛血清的低糖DMEM)充分混懸細胞，平均接種于細胞3個培養瓶中，置于37 ℃，5%CO2的細胞培養箱中培養，3天后首次換液，去除未能貼壁的細胞，之后每3～4天換液一次[6]。待細胞生長達80%～90%融合度時可用胰蛋白酶消化貼壁細胞進行傳代培養或凍存。在重復實驗中均能獲取大量的細胞，倒置顯微鏡下進行細胞計數發現細胞數量有一定差別，經培養后的細胞在細胞活性，傳代培養后的細胞性狀經倒置顯微鏡觀察無明顯差異。

1.3細胞表面標志鑒定在三次培養的細胞中分別取第3代生長良好的胎盤間充質干細胞，去除舊培養基，用PBS洗一遍后加入胰酶消化3 min，加入雙倍的完全培養基終止消化，離心棄上清，再用PBS洗滌離心處理兩次后，經細胞篩過濾后，加入PBS制成約1×106個·mL-1的細胞懸液，加入CD105,HLA-DR, CD34相關抗體后避光保存至少15 min后進行流式細胞檢測。間充質干細胞的特征性檢測指標是不表達造血干細胞的CD34和HLA-DR,而CD105持續陽性[7-9]。

2結果

2.1細胞觀察實驗重復三次的結果均發現，于倒置顯微鏡下均可見經淋巴細胞分離液分離后獲取的細胞以圓形為主，可見部分紅細胞或小組織塊(如圖1A所示)；接種于培養12 h左右細胞出現貼壁生長，呈梭形；72 h后細胞貼壁牢固，長梭形(如圖1B所示)；7天后可見細胞數量較多，呈貼壁生長，長梭形，類似成纖維細胞，與大部分干細胞形態相似，有的胞漿突起，少數呈多角形(如圖1C所示)；傳代后的細胞生長速度較快，鏡下觀察形態均一，少數呈多形性，呈平行排列或漩渦狀生長(如圖1D所示)。

A:剛接種至培養瓶中的細胞，細胞未貼壁，呈圓形×10；

B:培養72 h后的P1代細胞呈貼壁生長,長梭型×10；C:培養7天后的P1代細胞，細胞數量較多，部分生長較快×10；

D:經傳代后的P3代細胞培養7天后生長密集，平行排列或呈漩渦狀×10。

圖1胎盤間充質干細胞獲取及培養不同時期的形態學變化

2.2細胞表面標志鑒定分別取適量三次重復實驗的P3代細胞，經流式檢測結果示均為表達CD105(>80%),不表達HLA-DR(<1%), CD34(<1%),CD45(<2%)，符合胎盤間充質干細胞表面標記情況[7-9]，三次檢測結果在陽性細胞比例上有一定差異，證實了經上述方法獲取的細胞是胎盤間充質干細胞，鑒定結果如下(圖2、3)。

CD105，CD34，HLA-DR表達均為陰性。

圖2未染色胎盤間充質干細胞流式細胞檢測結果

CD105表達陽性，CD34，HLA-DR表達均為陰性。

圖3經染色處理的胎盤間充質干細胞流式細胞檢測結果

3討論

間充質干細胞自首次分離出來就引起了研究者的極大興趣，也是目前干細胞研究方向的一個新熱點[10]，間充質干細胞在一定的誘導條件下可以分化為多種人體組織細胞，具有非常廣泛的臨床應用前景[11-12]。但有分離純化困難的缺點，探索一種新的獲取途徑和更好的分離培養技術具有重要的意義。骨髓、脂肪組織等途徑均可獲取間充質干細胞，兩種方法獲取的細胞數量較少，且與供者的身體狀況，身體機能，年齡等相關[13]，并且從骨髓中獲取干細胞給提供者帶來較大的痛苦。相比于其他獲取途徑，胎盤是獲取間充質干細胞的可靠而且豐富的來源，分離獲得的細胞具有容易分離，增殖快速，分化能力強等特點，同時具有提取方便，無痛苦，感染機會少等優勢，且不涉及倫理道德問題[14-15]。不同來源的間充質干細胞具有不同的生長能力[16]，胎盤間充質干細胞活性較其他來源的間充質干細胞活性較好。以往的研究多采用胰蛋白酶或多種消化酶聯合消化組織后獲取干細胞，但胰蛋白酶消化能力強，聯合消化常會過度消化損傷細胞膜成分[8]，容易影響細胞的成活率和增殖能力，甚至導致細胞死亡，給后續培養帶來困難。Ⅱ型膠原酶消化能力相對較弱，但對細胞膜損害較小，既能充分的分離細胞，又能避免細胞的損傷。利用組織塊法也能獲得一定數量的間充質干細胞，但因其中可能混雜血管內皮細胞等細胞成分，在后期的分離過程中，組織塊的清除也有一定的困難，難以保證所培養細胞的純度[17]。胎盤組織中含有血管內皮細胞，血細胞及其他細胞，傳統酶消化后結合高速離心的方法將間充質干細胞與其他細胞分離效果不理想。本研究采用淋巴細胞分離液進行細胞分離，操作簡單并且獲取的細胞成分比較單一，為后續的培養帶來了方便。胎盤間充質干細胞呈貼壁生長，可以利用此特性與其他雜細胞進一步分離，但在培養早期，胎盤間充質干細胞貼壁不牢固，第一次換液時間過早將損失獲取的胎盤間充質干細胞。在重復的三次實驗中，由于組織的剪碎程度有差異及不同時間配制的消化酶濃度及環境溫度的影響，可能導致在初始階段獲取的細胞數量有一定差異，但經培養及傳代后，細胞活性未見明顯差異。

胎盤來源的間充質干細胞表面標志有一定的特異性，三次重復實驗的結果在表達上無明顯差異，在檢測的細胞比例上有一定的差異，這與實驗過程中細胞純化程度有關系，但獲取的細胞表達均>80%，可以滿足一般實驗的要求。有研究發現，胎盤來源的間充質干細胞還可表達部分胚胎干細胞表面標志物，這可能提示胎盤來源的多能間充質干細胞可能是非常原始的細胞群，與普通干細胞相比具有更加廣泛的多系分化能力[18],應用前景將更加廣泛。進一步探索一種更加高效地從胎盤中獲取間充質干細胞的方法顯得非常有必要。

通過對胎盤源間充質干細胞的生物學特性觀察及經流式細胞鑒定提示采用0.1%的Ⅱ型膠原酶消化已充分剪碎的胎盤組織可獲取較多數量的胎盤間充質干細胞，且活性較好。0.1%的Ⅱ型膠原酶消化30 min即可獲得大量細胞，延長時間至60 min，兩者間在細胞數量上無明顯差別，但消化時間的延長可能對細胞膜造成影響，后續的培養發現較長時間組增殖速度前期較慢，傳代后無明顯差異。所以通過機械剪碎胎盤組織結合使用Ⅱ型膠原酶消化可以縮短消化酶作用時間，更快捷的獲得胎盤源間充質干細胞，有利于提高細胞成活率，生長活性、擴增和傳代培養。對于以上結果，本研究進行了三次實驗驗證，說明通過機械剪碎胎盤組織，再使用0.1%的Ⅱ型膠原酶消化獲得胎盤源間充質干細胞的方法可靠性高，對比與之前獲取胎盤間充質干細胞的途徑有簡單、高效、獲取細胞數量多、細胞活性好等優點。這給臨床應用提供了良好的基礎。

本研究雖然為胎盤間充質干細胞的分離、培養及傳代探索了一種相對于傳統的方法更加簡單、快捷、高效的方法。但仍存在一定的缺陷，如對傳統不同消化酶的比較，同種酶不同濃度的比較等。對于這些缺陷，需要進一步的實驗進行探索和驗證，最終尋找到一種可靠性更強、效率更高的胎盤間充質干細胞分離、培養體系，為胎盤間充質干細胞的臨床應用提供扎實的基礎。

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Abstact:Objective:To investigate the feasibility of the combined use of mechanical minced placenta and enzymatic digestion to get and culture human placenta mesenchymal stem cells, and the biological identification of mesenchymal stem cells. Methods: Full-term human placenta was taken to seperate placental tissue cells by mechanical minced tissue joined with enzyme digestion. Placental tissue cells were purified by density gradient centrifugation, and further separated and purified with the growth characteristics of cells. Cells were observed under inverted microscope morphology and flow cytometry was adopted to identify cell surface markers. Results:Under inverted microscope, cells adherent growth, fusiform morphology, a small number of polygons were found. Placental tissues derived from mesenchymal stem cells in vitro could be long-term cultured stably. Flow cytometry showed that the expressions of CD73,CD90,CD105 were positive; the CD34,CD45,HLA-DR expressions were negative. Conclusion:Placenta derived mesenchymal stem cells can be efficiently obtained by the combined use of mechanical minced placenta and enzymatic digestion, can be cultured in vitro stably with high proliferative capacity, and can be long-term passed down or frozen.

Isolation, Cultivation and Biological Identification of Human Placenta Mesenchymal Stem Cells

LAIPing1,CHENYi-jian2a,LUOYao-ling2b,ZHANGMin-hong2b,YANGJian-qiong2b,QIUYue-qun2

(1.GraduateStudentinGrade2014,Gannanmedicaluniversity; 2.a.Dept.ofHematology;b.ClinicalResearchCenter,theFirstAffiliatedHospitalofGannanMedicalUniversity,Ganzhou,Jiangxi341000)

Key words:human placenta mesenchymal stem cells; mechanically minced; enzymatic digestion; stem cells culture

*基金項目：江西省科技支撐計劃項目(編號20141BBG70069)

通訊作者：邱悅群，男，主任醫師，教授，碩士生導師。E-mial:qiuyuequn66@sohu.com

中圖分類號：Q813.1

文獻標志碼：A

文章編號：1001-5779(2016)02-0183-04

DOI:10.3969/j.issn.1001-5779.2016.02.005

(收稿日期：2015-12-04)(責任編輯：敖慧斌)