新型組合型肝腎支持系統治療西藏小型豬急性腎衰模型的實驗研究*

馮　磊,何國林,熊龍輝,傅超毅,霍小林,高　毅△

(1.南方醫科大學珠江醫院肝膽二科/廣東省人工器官與組織工程研究中心/“器官衰竭”防治協同創新中心,廣州 510282;2.中國科學院電工研究所,北京 100190)

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新型組合型肝腎支持系統治療西藏小型豬急性腎衰模型的實驗研究*

馮磊1,何國林1,熊龍輝1,傅超毅1,霍小林2,高毅1△

(1.南方醫科大學珠江醫院肝膽二科/廣東省人工器官與組織工程研究中心/“器官衰竭”防治協同創新中心,廣州 510282;2.中國科學院電工研究所,北京 100190)

[摘要]目的評估新型組合型肝腎支持系統治療西藏小型豬腎衰模型的安全性及有效性。方法將5頭西藏小型豬采用結扎雙側腎動脈的方法構建腎衰模型，造模后治療組用新型組合型肝腎支持系統進行治療(CRRT模式)，對照組造模后不進行治療，在治療0、4、8 h抽取靜脈血進行內毒素、生化檢測及需氧菌培養厭氧菌培養，觀察造模前后、治療前后西藏小型豬的各項生化指標的變化；實驗過程中每2小時記錄儀器的各項壓力監測指標。結果兩組實驗動物腎衰模型均構建成功，治療組經過新型組合型肝腎支持系統治療后，一般情況改善；對照組動物一般情況持續惡化。實驗動物在實驗過程中，心電圖未出現明顯異常，兩組動物在0 h時生命體征差異無統計學意義(P>0.05)，其余時段治療組心率和呼吸頻率明顯低于對照組(P<0.05)，而血氧飽和度和平均動脈壓明顯高于對照組(P<0.05)；造模前兩組實驗動物的生化指標差異無統計學意義(P>0.05)；造模后兩組動物與造模前相比差異有統計學意義(P<0.05)；治療組經肝腎支持系統治療后，各項生化指標明顯下降，與治療前相比，差異有統計學意義(P<0.05)；而對照組未出現明顯變化。內毒素水平均低于0.5 EU/mL，動靜脈端需氧、厭氧菌培養結果顯示未見細菌生長。病理檢查見明顯的腎小管上皮腫脹、腎小管壞死。結論新型組合型肝腎支持系統用于治療西藏小型豬腎衰模型是安全、有效的，可進一步嘗試用于臨床試驗。

[關鍵詞]腎功能衰竭；組合型肝腎支持系統；西藏小型豬

急性腎衰竭(簡稱腎衰)是全世界發病率和死亡率均較高的一種疾病，其影響人數超過13億人，特別是在經濟不發達的地區，這些地區由于缺少腎臟替代治療的資源，死亡人數逐年上升[1]。因此，發展支持和替代腎功能的新方法具有重要意義[2]。臨床上主要通過藥物、血液透析及腎移植等方法治療，由于腎源缺乏，目前主要是通過血液透析維持患者生命狀態。本研究通過西藏小型豬來構建腎衰模型，并用新型組合型肝腎支持系統(又稱新型生物人工肝系統，自主研發)進行治療，以評估新型組合型肝腎支持系統治療西藏小型豬腎衰模型的安全性及有效性。

1材料與方法

1.1材料選擇5頭雄性西藏小型豬[來自南方醫科大學實驗動物中心，合格證號為：SCXK(粵)2011-0015]，8～9個月齡，體質量40～50 kg；所需材料包括新型組合型肝腎支持系統(由南方醫科大學珠江醫院聯合中國科學院電工研究所共同研發)、血液透析管路(自行設計)、血液透析器(費森尤斯AV600S)、一次性血液透析雙腔導管(廣東百合醫療)、一次性7F雙腔中心靜脈導管(廣東百合醫療)、有創血壓心電監護儀、鹽酸賽拉嗪注射液(陸眠寧Ⅱ)、丙泊酚注射乳劑、注射泵等。

1.2方法

1.2.1西藏小型豬腎衰模型的構建實驗前適應性喂養1周，術前禁食水12 h，自由飲水。速眠新Ⅱ肌肉注射誘導麻醉，于股動靜脈處備皮、消毒、鋪單，切開皮膚，暴露股動靜脈，行股動靜脈插管，抽血進行血生化、血常規和凝血功能檢測，經股靜脈持續泵入丙泊酚維持麻醉，待麻醉滿意后，進行心電監護，觀察實驗過程中心電圖、心率、呼吸頻率、血氧飽和度。于頸靜脈搏動處備皮、消毒、鋪單，切開皮膚，逐層分離，暴露頸靜脈，行頸內靜脈置管用于血液透析；腹正中區域備皮消毒，用利多卡因局部浸潤麻醉，切開皮膚，逐層打開腹腔，暴露膀胱，行膀胱造瘺以便于計算尿量；暴露雙側腎臟，解剖分離雙側腎動脈，結扎雙側腎動脈，消毒關腹，將模型豬放入飼養室，給予補液，靜待其蘇醒，并取血檢測腎功能。當肌酐大于706 μmol/L或血鉀大于6.5 mmol/L時開始上機進行透析治療。

1.2.2置換液的配制將置換液配制成白袋和紫袋兩袋，白袋：生理鹽水3 000 mL、10% KCl 24 mL、25% MgSO46 mL、5%NaHCO3500 mL和注射用水750 mL；紫袋：生理鹽水3 000 mL、5%葡萄糖溶液460 mL、5% CaCl250 mL和注射用水750 mL；所有液體均在超凈臺內配制，嚴格無菌操作，置換液配置好后，治療過程中經不同通路同時輸入血液管路。

1.2.3腎衰模型豬的上機治療腎衰模型豬制備好后，隨機將其分為治療組(n=3)和對照組(n=2)，按CRRT模式進行管路連接，模型豬上機前所有管路以及濾器用加入12 500 U肝素鈉的706代血漿進行預充，給予靜脈注射地塞米松5 mg，鹽酸異丙嗪注射液25 mg肌肉注射，經雙腔管按0.5 mg/kg給予肝素，同時啟動肝素泵，按0.05 mg·kg-1·h-1追加肝素，實時監測活化部分凝血酶時間(APTT)，根據APTT值調整肝素泵的速率，治療結束前1 h停止追加肝素[3]。血泵流量調節為50 mL/min，棄漿泵流量調節為10 mL/min，返漿泵流量調節為5 mL/min，補液泵流量調節為5 mL/min，超濾率20%。治療組進行CRRT模式治療，對照組按實驗組方式連接，但不加透析器和置換液，僅補充生理鹽水及葡萄糖。連接壓力監測器，檢查各個報警裝置。每頭模型豬治療8 h，每隔2小時記錄1次靜脈壓、跨膜壓，動態監測豬的動脈血壓、血氧飽和度、心率、呼吸、心電圖。治療過程中，每隔2小時輸入0.9%生理鹽水200 mL進行沖管，以防止濾器和管路堵塞，密切注意西藏小型豬的胸廓起伏、生命體征的變化。同時從實驗開始第0、4、8 h股靜脈采血進行血培養、內毒素、血生化、血常規和凝血功能檢測(南方醫科大學珠江醫院檢驗科)。治療結束后，繼續觀察實驗豬飲食、飲水、生命體征等變化[3]。

2結果

2.1一般情況所有實驗豬腎衰模型均構建成功，造模過程中未出現麻醉過量、失血過多等狀況，造模后西藏小型豬尿量明顯減少，精神萎靡，進食減少。治療組經過新型組合型肝腎支持系統治療后，一般情況改善，進食增加。對照組動物一般情況持續惡化。治療過程中機器各項監測系統正常，未出現異常狀況。

2.2兩組實驗動物生命體征的變化實驗動物在實驗過程中，心電圖未出現明顯異常，兩組實驗動物在0 h時生命體征差異無統計學意義(P>0.05)，其余時段治療組心率和呼吸頻率明顯低于對照組(P<0.05)，而血氧飽和度和平均動脈壓明顯高于對照組(P<0.05)，見表1。

2.3造模前后及治療4、8 h后的生化指標變化造模前兩組實驗動物的生化指標差異無統計學意義(P>0.05)；造模后兩組動物與造模前相比差異有統計學意義(P<0.05)；治療組經肝腎支持系統治療后，各項生化指標明顯下降，與治療前相比，差異有統計學意義(P<0.05)；而對照組未出現明顯變化(圖1)。

2.4污染情況實驗第0、4、8小時采血所測得的內毒素結果均小于0.5 EU/mL，動靜脈端需氧、厭氧菌培養結果顯示未見細菌生長。

2.5病理檢測結果造模前腎組織中腎小球、腎小管結構清楚、正常；造模后能看見明顯的腎小管上皮腫脹、腎小管壞死(圖2)。

表1　實驗動物生命體征的變化±s)

a:造模前；b:造模后；c:上機4 h;d:上機8 h。

圖1實驗動物生化指標的變化

A:造模前腎組織(HE×10)；B:造模前腎組織(HE×40)；C：造模后腎組織(HE×10)；D：造模后腎組織(HE×40)。

圖2實驗動物造模前后病理變化

3討論

急性腎衰竭是由各種原因引起的腎功能在短時間內突然下降而出現的氮質廢物滯留和尿量減少綜合征，其主要表現為氮質廢物血肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)升高，水、電解質和酸堿平衡紊亂及全身各系統并發癥[4]。目前，臨床上主要利用血液透析來維持患者的生命，透析機品種多種多樣，各有其優缺點[5-6]。本研究首次使用自主研發的新型組合型肝腎支持系統來進行腎衰竭動物模型的治療，該支持系統具有獨特的特點：(1)能夠同時進行肝腎功能支持(人工肝以及CRRT持續性腎臟替代治療)；(2)能夠選擇多種治療模式進行血液凈化治療；(3)高度智能化以及程序機能化，操作簡單、方便，能提供數據的安全操作。

本課題組前期實驗[3]已經證明該新型組合型肝腎支持系統是安全的。實驗中抽取動靜脈端血液進行內毒素及需氧、厭氧菌培養，結果顯示內毒素水平低于0.5 EU/mL，需氧厭氧菌培養顯示未見細菌生長；治療組動物生命體征平穩，未出現明顯波動，兩組實驗動物在0 h時生命體征差異無統計學意義(P>0.05)，治療組其余時段與對照組相比，心率和呼吸頻率明顯低于對照組(P<0.05)，而血氧飽和度和平均動脈壓明顯高于對照組(P<0.05)，實驗動物的生命安全得以保證，再次證實了該機器的安全性。

臨床工作中常遇見多器官衰竭的患者，醫學工作者不斷致力于提高多器官衰竭患者搶救成功率的研究，收到了一定的成效，但是多器官衰竭患者的死亡率依然很高[7]。血液透析患者經輸血或接觸血液污染的醫療器械發生乙型肝炎的機會明顯增加，慢性腎衰維持血液透析患者多伴有免疫功能低下，感染乙型肝炎后病原體不易在體內消失，常成為長期抗原攜帶者，加上起病隱匿癥狀輕，易被漏診和轉化為慢性遷延性肝炎，從而導致肝衰竭[8]。在腎衰并發肝衰竭的情況下，應用具有多功能的治療機器將具有重要的意義；本研究中使用的新型組合型肝腎支持系統能滿足這種患者的需求，因此將其應用于臨床將具有重大意義。

本實驗成功與否的關鍵在于西藏小型豬腎衰模型的構建，目前構建腎衰竭動物模型的方法主要包括缺血再灌注損傷模型[9-10]、結扎雙側腎動脈模型[11]及藥物誘導模型[12]。腎組織缺血是導致腎損傷的常見病理機制，本實驗運用結扎雙側腎動脈來構建西藏小型豬急性腎衰竭模型，該方法具有造模時間快，可重復性好等優點。因西藏小型豬各項生化指標與人類較相近[13-14]，所以用其造模并進行治療，對于臨床治療可提供相應的經驗。造模前實驗動物的各項生化指標均處于正常水平，造模24 h后均明顯升高，治療組經新型組合型肝腎支持系統治療后，各項生化指標明顯下降，與治療前相比，差異有統計學意義(P<0.05)；而對照組未出現明顯變化。實驗中，結扎雙側腎動脈24 h后，發現丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)有所升高，說明腎衰后，對肝功能有一定的影響；經過機器治療后，AST、ALT明顯下降并趨于正常水平。

綜上所述，新型組合型肝腎支持系統在治療過程中，機器運行平穩正常，實驗動物生命體征平穩，未出現異常狀況，其用于治療西藏小型豬腎衰模型是安全、有效的，可嘗試進一步用于非人靈長類動物試驗，并過渡到臨床試驗。

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Experimental study of Tibet miniature pig model of acute renal failure treated by a novel hybrid liver and renal support system*

Feng Lei1,He Guolin1,Xiong Longhui1,Fu Chaoyi1,Huo Xiaolin2,Gao Yi1△

(1.Second Department of Hepatobiliary Surgery,Zhujiang Hospital,Southern Medical University/ Guangdong Provincial Research Center of Artificialorgan and Tissue Engineering/Co-Innovation Center of Organ Failure Research Guangzhou,Guangdong 510282,China;2.Institute of Electrical Engineering Chinese Academy of Sciences，Beijing 100190,China)

[Abstract]ObjectiveTo evaluate the novel hybrid liver and renal support system the safety and efficacy of the treatment of Tibet mini pig model of renal failure.MethodsFive Tibet miniature pig bilateral renal artery ligation approached to construct the models of renal failure,treatment group was treated with therapy (CRRT mode) of the novel hybrid liver and renal support system after modeling,while the control group received no treatment.Drawning venous blood endotoxin,biochemical tests and aerobic anaerobic culture when in the treatment of 0,4,8 h;then we observed the changes of biochemical indicators in Tibet mini pigs before and after treatment;we recorded machine pressure monitoring indicators every 2 hour during treatment.ResultsThe model of renal failure of two experimental animals were successfully constructed.The general condition of treatment group was improved after treated by the novel hybrid liver and renal support system,while the control groups continued to deteriorate.The experimental animals did not appear abnormal ECG during the experiment.Two groups of animals showed no statistics significant difference (P>0.05) in the period of 0 h.In the remaining period,heart rate and respiratory rate in treatment group was significantly reduced(P<0.05),while oxygen saturation and mean arterial pressure were significantly increased compared to control group(P<0.05).There was no differences of biochemical indicators between two groups before modeling (P>0.05);after modeling both groups biochemical indicators was significantly increased compared with baseline (P<0.05);after treatment of the hybrid liver and renal support systems in the treatment group,the biochemical parameters were significantly decreased compared with baseline,the difference was statistically significant different(P<0.05),while the control group did not change significantly.Blood endotoxin measured results were less than 0.5 EU/mL,arteriovenous end aerobic anaerobic culture showed no bacterial growth.Pathological examination showed significant swelling of the renal tubular epithelium and tubular necrosis.ConclusionThe novel hybrid liver and renal support system for the treatment of Tibet mini-pig model of renal failure is safe and effective,and it can be further attempts for clinical trials.

[Key words]kidney failure；hybrid liver and renal support system;Tibet miniature pig

doi:·論著·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.08.001

* 基金項目：國家高技術研究發展計劃(863計劃)資助項目(2012AA020505)；國家自然科學基金資助項目(81470875)；廣東省自然科學基金項目(2014A030312013)；廣東省級科技計劃項目(2014B020227002)；南方醫科大學交叉學科創新團隊培養計劃項目；廣東省醫學科研基金資助項目(C1036114)。

作者簡介：馮磊(1989-)，碩士，住院醫師，主要從事生物人工肝的研發與動物實驗。△通訊作者：E-mail：gaoyi6146@163.com。

[中圖分類號]R692.5

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)08-1009-03

(收稿日期：2015-10-14修回日期：2015-12-15)