內毒素脂多糖（LPS）對人牙周膜成纖維細胞TNF-α、IL- 6表達的影響

袁雪明　劉陸濱▲　趙志香.佳木斯大學附屬第二醫院口腔醫院牙體二科，黑龍江佳木斯　54002；2.佳木斯大學，黑龍江佳木斯　54002

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內毒素脂多糖（LPS）對人牙周膜成纖維細胞TNF-α、IL- 6表達的影響

袁雪明1劉陸濱1▲趙志香2△
1.佳木斯大學附屬第二醫院口腔醫院牙體二科，黑龍江佳木斯154002；2.佳木斯大學，黑龍江佳木斯154002

［摘要］目的研究內毒素脂多糖（LPS）對人牙周膜成纖維細胞TNF-α、IL-6表達的影響。方法培養HPLFs細胞，將細胞分為LPS刺激0 mg/L（對照組）、1 mg/L（實驗Ⅰ組）、10 mg/L（實驗Ⅱ組），應用ELISA法檢測IL-6、TNF-α因子的表達情況。結果LPS刺激6 h時，HPLFs中TNF-α、IL-6的表達量顯示：Ⅰ、Ⅱ組顯著高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。LPS刺激12 h時，HPLFs中TNF-α、IL-6的表達量顯示：Ⅰ、Ⅱ組也顯著高于對照組，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。HPLFs細胞中TNF-α、IL-6的表達隨LPS刺激濃度呈劑量依賴性；且對照組、及Ⅰ組、Ⅱ組經LPS刺激12 h的TNF-α、IL-6表達均顯著高于刺激6 h，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。結論內毒素脂多糖（LPS）能夠刺激人牙周膜成纖維細胞分泌TNF-α、IL-6炎癥因子。

［關鍵詞］內毒素脂多糖（LPS）；人牙周膜成纖維細胞；TNF-α；IL-6

▲通訊作者

△在讀碩士研究生

革蘭陰性菌的內毒素脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）是一種公認的重要的牙周病致病因子，研究發現，其具有調節細胞的生長、合成代謝，并刺激巨噬細胞、單核細胞、成纖維細胞等分泌IL-6、TNF-α等多種炎癥介質的作用［1］。牙周膜成纖維細胞（human periodontal fibroblast，HPLFs）是牙周組織中數量最多的細胞，牙周膜成纖維細胞（HPLFs）在牙周組織健康中發揮著重要作用［2］。本實驗旨在探討經脂多糖刺激后的牙周膜成纖維細胞炎癥因子IL-6、TNF-α表達情況，現報道如下。

1　材料與方法

1.1一般材料

DMEM培養液（Gibco，USA）；牛血清（Gibco，USA）；LPS從細菌Salmonella minnesota Re595中提取并保存。鼠SP免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒；CO2培養箱（Yamato，Japan）；超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術公司）；倒置顯微鏡（廣西梧洲市光學儀器廠）；酶標分析儀（Thermo corporation，USA）；多功能真彩色細胞圖像分析管理系統（Media Cybernetics，USA）。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒（R&D systems，美國），白細胞介素-6（IL-6）試劑盒（R&D systems，美國）。

1.2方法

1.2.1HPLFs的取材、體外分離和培養選擇2013年1月～2014年1月我院因阻生齒而行拔除術中分離的新鮮健康牙周膜組織，入選患者共12例，其中男7例，女5例，年齡范圍18～28歲，無齲病、牙周病和根尖周病，3個月內未使用抗生素類、激素類藥物，無糖尿病史、心血管病史、吸煙史等。將牙周膜組織在超凈臺內剪碎，應用含有100 U雙抗PBS緩沖液進行沖洗，去除表面的凝血塊及殘留物質，用2 U/mL的DispaseⅡ分散酶浸泡16～18 h，剝除牙周膜上皮組織，采用組織塊法進行HPLFs的原代細胞培養，標準培養條件：37℃，950 mL/L空氣，50 mL/L CO2，100%濕度，取第2～3代細胞進行實驗。

1.2.2分組將培養的HPLFs細胞以5×105/孔密度接種于6孔板，加入適量DMEM培養液，培養至細胞生長達80%匯合后棄原培養液，對照組為不含LPS的20 mL/L胎牛血清DMEM，PBS緩沖液沖洗細胞2次，細胞用0.25%戊二醛固定。實驗組加入預先配置的LPS，使其濃度分別為1 mg/L、10 mg/L，將細胞分為LPS刺激0 mg/L（對照組）、1 mg/L（實驗Ⅰ組）、10 mg/L（實驗Ⅱ組），分別于LPS刺激6 h和12 h后每孔加入1 mL Trizol進行細胞裂解，提取總RNA及合成cDNA。1.2.3 IL-6、TNF-α的檢測加入LPS刺激6、12 h收集上清液150 μL，應用據ELISA間接夾心法檢測IL-6、TNF-α因子的表達情況，按試劑盒說明嚴格操作。

1.3統計學方法

本研究數據分析采用SPSS12.0統計學軟件進行分析，其中計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，多組間比較進行方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1內毒素脂多糖（LPS）對人牙周膜成纖維細胞TNF-α表達的影響

見表1。LPS刺激6 h時，HPLFs中TNF-α的表達量顯示：Ⅰ、Ⅱ組顯著高于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。LPS刺激12 h時，HPLFs中TNF-α的表達量顯示：Ⅰ、Ⅱ組也顯著高于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.01）。HPLFs細胞中TNF-α的表達隨LPS刺激濃度呈劑量依賴性；且對照組、Ⅰ組、Ⅱ組經LPS刺激12 h的TNF-α表達均顯著高于刺激6 h，差異具有高度統計學意義（P＜0.01）。

2.2內毒素脂多糖（LPS）對人牙周膜成纖維細胞IL-6表達的影響

見表2。LPS刺激6 h時，HPLFs中IL-6的表達量顯示：Ⅰ、Ⅱ組顯著高于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。LPS刺激12 h時，HPLFs中IL-6的表達量顯示：Ⅰ、Ⅱ組也顯著高于對照組，差異具有高度統計學意義（P＜0.01）。HPLFs細胞中IL-6的表達隨LPS刺激濃度呈劑量依賴性；且對照組、Ⅰ組、Ⅱ組經LPS刺激12 h的IL-6表達均顯著高于刺激6 h，差異具有高度統計學意義（P＜0.01）。

表1　內毒素脂多糖（LPS）對人牙周膜成纖維細胞TNF-α表達的影響（±s，ng/L）

表1　內毒素脂多糖（LPS）對人牙周膜成纖維細胞TNF-α表達的影響（±s，ng/L）

注：各組刺激6 h：F=23.539，P＜0.01；各組刺激12 h：F=31.532，P＜0.01；分別與對照組比較，t=23.643、45.213、51.364、45.321，*P＜0.01；分別與刺激6 h比較，t=8.342、19.235、94.342，#P＜0.01

組別　LPS刺激6 h　LPS刺激12 h對照組（0 mg/L）Ⅰ組（1 mg/L）Ⅱ組（10 mg/L）26.32±3.64 157.80±24.97*263.30±39.25*62.36±11.29#392.3±95.41*#428.27±71.32*#

表2　內毒素脂多糖（LPS）對人牙周膜成纖維細胞IL-6表達的影響（±s，ng/L）

表2　內毒素脂多糖（LPS）對人牙周膜成纖維細胞IL-6表達的影響（±s，ng/L）

注：各組刺激6 h：F=11.342，P＜0.01；各組刺激12 h：F=21.53，P＜0.01；分別與對照組比較，t=7.342、8.231、36.231、32.643，*P＜0.01；分別與刺激6 h比較，t=5.321、12.932、23.984，#P＜0.01

組別　刺激6 h　刺激12 h對照組（0 mg/L）Ⅰ組（1 mg/L）Ⅱ組（10 mg/L）21.63±4.22 62.27±11.39*83.11±13.26*38.23±5.38#112.62±23.75*#127.34±22.97*#

3　討論

牙周炎癥是以革蘭陰性厭氧桿菌為主要致病菌的混合感染，革蘭陰性厭氧桿菌的主要毒力因子之一是其細菌外膜成分脂多糖（LPS）。且研究發現，齦溝液中IL-6、TNF-α等細胞因子參與了牙周炎的炎癥過程。

本實驗采用LPS作為刺激源，檢測重要炎癥介質IL-6、TNF-α在體外培養牙周膜成纖維細胞（HPLFs）中的表達，以探討LPS對牙周膜成纖維細胞的牙周炎癥的作用［3-5］。牙周膜成纖維細胞是牙周組織內主要的細胞成分，近年來的研究表明，成纖維細胞可與脂多糖直接作用，作為免疫輔助細胞參與牙周組織的破壞過程，產生炎癥細胞因子，介導炎癥反應，參與牙周炎的發生和發展，在LPS引起的牙周炎組織病理損害過程中具有重要作用［6-8］。

TNF-α和IL-6是牙周炎病理發生的關鍵炎癥因子，僅能夠誘導巨噬細胞和牙周膜成纖維細胞產生前列腺E2，活化破骨細胞，促進骨吸收，抑制膠原合成，加速牙周組織破壞，還可以增強血管的通透性誘導白細胞移出，在牙周組織的局部炎癥破壞中具有重要作用［9-11］。

本研究通過培養HPLFs細胞，將細胞分為LPS刺激0 mg/L（對照組）、1 mg/L（實驗I組）、10 mg/L（實驗Ⅱ組），應用ELISA法檢測IL-6、TNF-α因子的表達情況。研究結果顯示，LPS刺激6 h時，1mg/L LPS 和10 mg/L LPS兩組中的IL-6、TNF-α水平分別顯著高于對照組，LPS刺激12 h時，1 mg/L LPS和10 mg/L LPS兩組中的IL-6、TNF-α水平也分別顯著高于對照組，差異具有高度統計學意義（P＜0.01），說明HPLFs細胞中TNF-α、IL-6的表達隨LPS刺激濃度呈劑量依賴性；且對照組、Ⅰ組、Ⅱ組經LPS刺激12 h的TNF-α、IL-6表達均顯著高于刺激6 h，差異具有高度統計學意義（P＜0.01），說明LPS能通過刺激HPLFs產生炎癥細胞因子，促進牙周炎癥的發生和發展。

HPLFs可能作為免疫激活輔助細胞，在LPS作用下產生TNF-α、IL-6等細胞因子，參與局部免疫反應，在牙周炎發生發展中發揮重要作用。HPLFs獲得免疫輔助細胞活性的同時，可能會喪失其多向分化潛能活性，影響牙周組織代謝和修復過程［12-14］。

綜上，我們認為，內毒素脂多糖（LPS）能夠刺激人牙周膜成纖維細胞分泌TNF-α、IL-6炎癥因子，參與了牙周炎的發生和發展過程。脂多糖的細胞毒作用直接影響著牙周膜成纖維細胞的生長與增殖，還能刺激巨噬細胞、單核細胞、成纖維細胞等分泌白細胞介素-6、腫瘤壞死因子-α等多種炎性細胞因子，對炎性反應起決定作用［15］，因此，研究阻斷細胞因子的分泌對未來預防和治療牙周病具有十分重要的意義，值得進一步深入開展研究。

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Effect of lipopolysaccharide（LPS）on the expression of TNF-α and IL-6 in Human periodontal fibroblast cells

YUAN Xueming1LIU Lubin1ZHAO Zhixiang2
1.Department of 2nd Dental，the Stomatology Hospital of Second Affiliated Hospital of Jiamusi University，Jiamusi 154002，China；2.Jiamusi University，Jiamusi 154002，China

［Abstract］Objective To study the effect of lipopolysaccharide（LPS）on the expression of TNF-α and IL-6 in human periodontal fibroblast cells. Methods HPLFs cells were cultured. The cells were divided into LPS stimulated 0 mg/L （control group），1 mg/L（experimental groupⅠ）and 10 mg/L（experimental groupⅡ）. The expression of IL-6 and TNF-α was detected by ELISA method. Results The expression of LPS，TNF-α and IL-6 in HPLFs was significantly higher than that in control group at 6 hours，the expression of groupⅡand groupⅠwas significantly higher than that in control group，the difference was statistically significant（P＜0.05）. The expression of I and TNF-in HPLFs was significantly higher than that in control group，the difference was statistically significant in the expression groupⅡand IL-6 in LPS in 12 hours（P＜0.01）. The expression of TNF-α and IL-6 in HPLFs cells with LPS stimulus concentration in a dosedependent manner；and the control group，and groupⅠ，groupⅡby LPS stimulation the expressions of 12 hours of TNF-α and IL-6 were significantly higher than those in the 6 h of stimulation，the difference was statistically significant（P＜0.01）. Conclusion Lipopolysaccharide（LPS）can stimulate the secretion of TNF-α and IL-6 inflammatory factors in human periodontal fibroblast cells.

［Key words］Lipopolysaccharide lipopolysaccharide（LPS）；Human periodontal fibroblast；TNF-α；IL-6

［中圖分類號］R780.2

［文獻標識碼］B

［文章編號］1673-9701（2016）10-0001-03

收稿日期：（2016-01-08）