miR-302a對葉酸缺乏小鼠胚胎干細胞增殖和凋亡的影響

陽　倩，石　偉

(四川省醫學科學院/四川省人民醫院兒科，成都 610017)

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miR-302a對葉酸缺乏小鼠胚胎干細胞增殖和凋亡的影響

陽倩，石偉△

(四川省醫學科學院/四川省人民醫院兒科，成都 610017)

[摘要]目的探討miR-302a對葉酸缺乏小鼠胚胎干細胞(mESC)增殖和凋亡的影響。方法mESC分為完全培養基組(對照組)，無葉酸培養基組(無葉酸組)，無葉酸培養基+miR-302a mimic組(miR-302a組)，通過RT-PCR進行檢測miR-302a在完全培養基及無葉酸培養基中的表達。構建miR-302a mimic，后轉染到無葉酸培養基mESC中，采用MTT法檢測miR-302a mimic對mESC活力的影響，Annexin V-FITC/PI流式細胞術檢測miR-302a mimic對mESC細胞凋亡的影響；流式細胞術檢測miR-302a mimic對mESC細胞周期的影響；Western blot檢測及磷脂酰肌醇3羥激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路激活情況，以及下游分子細胞周期蛋白D1(CyclinD1)、p21、p27表達的影響。結果RT-PCR證實無葉酸組中miR-302a表達量下降(P<0.01)。與完全培養基比較，無葉酸培養基中，mESC 細胞活力下降，細胞凋亡增加，細胞周期阻滯在G1期，Akt及mTOR磷酸化水平下降，CyclinD1表達下調，p21及p27表達上調，差異均具有統計學意義(P<0.01)。與無葉酸組比較，miR-302a組中，mESC 細胞活力上升，凋亡下降，G1期縮短，AKT及mTOR磷酸化水平提高，CyclinD1表達上調，p21及p27表達下調，差異均具有統計學意義(P<0.01)。結論miR-302a類似物能顯著抑制缺乏葉酸mESC凋亡，能促進其增值，與PI3K/AKT/mTOR信號通路有關。

[關鍵詞]葉酸；小鼠；胚胎干細胞；增殖；凋亡；miR-302a

胚胎生長發育涉及胚胎干細胞生長、分化、死亡及至器官形成等過程，受環境因素、遺傳基因及信號通路等的影響。一些微量必需元素的缺乏會導致胚胎生長畸形，如葉酸，是一種水溶性B族維生素，只能從食物中攝取，人體內不能合成，以其代謝物四氫葉酸來參與一碳單位和DNA合成，間接參與DNA甲基化過程[1]。目前已證實在外周血淋巴細胞系，我國倉鼠卵巢細胞等中，葉酸缺乏會引起全基因組不穩定性和低甲基化，進而引起細胞增殖緩慢及凋亡率上升，并細胞周期阻滯在G1期[2]。梁燕等[3]也證實葉酸缺乏會抑制小鼠胚胎干細胞(mouse embryonic stem cell，mESC)增殖，與葉酸缺乏誘導的細胞周期特異性凋亡有關。

MicroRNA(miRNAs)是一類進化上高度保守的內源性非編碼小分子RNA，它能夠結合于靶基因mRNA的3′-UTR區域，使靶基因降解或阻遏靶基因翻譯，從而抑制靶基因表達，具有嚴格的組織特異性和時序性。miRNA可調控胚胎干細胞命運，參與一系列胚胎發育重要進程，如早期胚胎發育、細胞增殖、細胞凋亡等[4]。在胚胎發育過程中，如果miRNA加工過程或Dicer酶發生突變，導致胚胎干細胞分化異常，使胚胎不能形成正常器官形態，嚴重影響胚胎發育早期。miR-302家族是胚胎干細胞特異miRNA家族，可以通過調節細胞周期相關蛋白表達，促進G1/S期轉化[5]。因而推測miR-302能通過促使G1到S期轉化，從而抑制葉酸缺乏引起的胚胎干細胞損傷。胚胎干細胞是從早期胚胎內細胞團和原始生殖細胞中分離出來的全能干細胞，可在體外培養，且具有自我更新及多向分化的特點。mESC的體外培養目前應用廣泛，操作技術成熟，是研究胚胎發育、遺傳疾病等的理想模型。因此本文在此基礎上探討miR-302a對于葉酸缺乏胚胎干細胞增殖及凋亡的影響及其作用機制。

1材料與方法

1.1主要試劑及儀器MTT(Sigma公司)；兔抗CyclinD1、p27、p21抗體(Epitmics公司)；兔抗Akt、p-Akt、mTOR抗體(Cell Signaling Techonology)；GADPH、Annexin V/PI雙染檢測試劑盒(碧云天生物技術研究所)；胎牛血清、高糖DMEM培養基(含葉酸)、胰蛋白酶(美國Gibco公司)；DMEM高糖培養基(不含葉酸)(北京思賽因公司)；葉酸(Sigma公司)。CO2培養箱(Thermo Scientific公司)；生物安全柜(Thermo Scientific公司)；倒置顯微鏡(Nikon公司)；流式細胞儀(BD 公司)；迷你雙垂直電泳儀、迷你轉印電泳儀、ChemiDocTMXRS凝膠成像系統(Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養mESC R1細胞系由中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所，貨號：SCSP-223。飼養層細胞為小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblasts，MEF)，此細胞經過伽馬射線輻射后失去分裂能力，接種在含0.1%明膠處理過的細胞培養皿中，待24 h完全貼壁后，將mESC細胞接種到此飼養層細胞上，2～3 d后傳代到無0.1%明膠的皿中，以除去MEF。mESC細胞培養基需再加入1 mL/L β巰基乙醇，10 μg/L重組人白血病抑制因子等。

1.2.2miRNA合成與轉染在廣州市銳博生物科技有限公司訂購合成miR-302a mimic及對照negative control。miR-302a mimics:sense 5′-UAA GUG CUU CCA UGU UUU GGY GA-3′，anti-sense 5′-ACC AAA ACA CAU GGA AGC ACU UAU U-3′。negative control：sense 5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′，anti-sense 5′-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3′。

1.2.3RT-PCR檢測miR-302在mESC及葉酸缺乏mESC中的表達總RNA的提取參考trizol試劑盒 (Invitrogen) 使用說明書，引物設計如下。miR-302a基因引物序列：5′-GTC GTA TCC AGT GCG TGT CGT GGA GTC GGC AAT TGC ACT GGA TAC GAC TCA CCA A-3′，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內參標記物，引物序列：5′-TGA CTT CAA CAG CGA CAC CCA-3′。通過一步法RT-PCR試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA并進行PCR擴增，獲取5 μL擴增產物用于下一步2%的瓊脂糖膠進行檢測。紫外分光光度計檢測電泳條帶并拍照。

1.2.4MTT法測mESC增殖率96孔板中MEF作為飼養層，mESC接種于飼養層上，當細胞匯合度達到70%時，分別轉染miR-302a mimic和negative control，轉染濃度分別為50 nmol、200 nmol，轉染達到72 h后，加入20 μL 5 mg/mL MTT，繼續培養4 h后吸棄培養液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩使結晶物充分溶解，于酶標儀560 nm處測A值，以630 nm作為參比波長計算相對增殖率。

1.2.5細胞凋亡檢測6孔板中MEF作為飼養層，mESC接種于飼養層上，當細胞匯合度達到70%時，分別轉染miR-302a mimic、negative control，轉染濃度分別為50 nmol、200 nmol，24 h后消化收集細胞，避光染色30 min上機檢測。按照Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書的方法，用0.25%的胰蛋白酶(不含EDTA)消化，PBS洗滌，2 000 r/min離心5 min，收集細胞；加入Binding Buffer 500 μL懸浮細胞，隨后加入Annexin V-FITC 5 μL混勻后，加入PI 5 μL，混勻，于室溫避光反應5～15 min，在1 h內進行流式細胞儀檢測。

1.2.6細胞周期檢測6孔板中MEF作為飼養層，mESC接種于飼養層上，當細胞匯合度達到70%時，分別轉染miR-302a mimic、negative control，轉染濃度分別為50 nmol、200 nmol，24 h后消化收集細胞，避光染色30 min上機檢測。

1.2.7Western blot6孔板中MEF作為飼養層，mESC接種于飼養層上，當細胞匯合度達到70%時，分別轉染miR-302a mimic、negative control，轉染濃度分別為50 nmol、200 nmol，24 h后消化收集細胞，離心，后加入適量的RIPA裂解液，每隔10 min置于渦旋儀中振蕩30 s，40 min后，4 ℃，10 000 r/min離心10 min，小心吸取上清液，即可獲得總蛋白。根據BCA試劑盒對蛋白濃度進行測定。蛋白上樣，跑SDS凝膠電泳，后濕法磚膜。將膜浸入一抗溶液孵育，4 ℃過夜；漂洗后，浸入二抗溶液中室溫孵育1～2 h。將膜取出漂洗，在膜上滴加ECL曝光液，在凝膠成像系統中曝光。用“Quantity one”軟件對各抗體條帶灰度值進行統計。

2結果

2.1miR-302a在mESC及缺乏葉酸mESC中的表達RT-PCR結果顯示，無葉酸組中miR-302a表達量顯著下降，差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

2.2miR-302a對mESC活力影響與對照組比較，無葉酸組細胞活力下降，差異具有統計學意義(P<0.05)；與無葉酸組比較，miR-302a組能顯著提高細胞活力，差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

2.3miR-302a對mESC細胞凋亡的影響與對照組比較，無葉酸組中細胞凋亡增加，差異具有統計學意義(P<0.05)；與無葉酸組比較，miR-302a組細胞凋亡減少，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表1。

2.4miR-302a對mESC細胞周期的影響與對照組比較，無葉酸組細胞周期阻滯在G1期，差異具有統計學意義(P<0.05)；與無葉酸組比較，miR-302a組中G1期縮短，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表2。

圖1　miR-302a在mESC及缺乏葉酸mESC中的表達

圖2　miR-302a對mESC活力影響

表1　miR-302a對mESC細胞凋亡的影響

表2　miR-302a對缺乏葉酸mESC細胞周期的影響，%)

2.5miR-302a對mESC細胞中PI3K/Akt/mTOR信號通路相關蛋白表達的影響與對照組比較，無葉酸組Akt和mTOR磷酸化水平下降，差異均具有統計學意義(P<0.05)；與無葉酸組比較，miR-302a組能提高Akt和mTOR磷酸化水平，差異均具有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

2.6miR-302a對mESC中細胞周期相關蛋白表達的影響與對照組比較，無葉酸組中CyclinD1表達下調，p21、p27表達上調，差異均具有統計學意義(P<0.05)；與無葉酸組比較，miR-302a組能上調CyclinD1表達，下調p21、p27表達，差異均具有統計學意義(P<0.05)，見圖4。

圖3　miR-302a對mESC細胞中PI3K/Akt信號通路相關蛋白表達的影響

圖4　miR-302a對缺乏葉酸mESC中細胞周期相關蛋白表達的影響

3討論

miR-302家族是胚胎干細胞特異性miRNA，能通過調控CyclinD1和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，促進G1期向S期進展，進而促進細胞增殖，保持胚胎干細胞的特性[5]。miR-302首先在mESC中克隆得到，在其他的成年細胞中均未克隆到，且發現miR-302只特異性的高表達于未分化的人胚胎干細胞、mESC、犬胚胎干細胞中，一旦進入分化階段，其表達量下降[5-6]。miR-302在ESC中表達量較高[6]。miR-302在未分化ESC中表達量較高，分化后表達量下降[7]。本實驗也發現，在無葉酸組中，miR-302a表達量下降。

細胞增殖分裂是細胞重要生命特征之一。胚胎干細胞細胞周期G1期較短，與腫瘤細胞相似，一個細胞周期為11 h，G1期只有2 h，整個細胞周期活躍，細胞增殖快速。CyclinD1是G1期關鍵蛋白，最先在G1期被合成，并且在G0/G1期到S期的進程中發揮關鍵作用。CyclinD1和細胞周期依賴蛋白激酶(CDK4)結合，形成CyclinDa-CDK復合物，導致CDK的蛋白激酶活化，通過一系列調控作用，使細胞通過限制點進入S期，引起細胞分裂。p21和p27是細胞周期依賴性激酶抑制劑，與CyclinD1競爭可Cyclin-CDK復合物或細胞增殖抗原的活性，使細胞不能通過G1期。miR-294/miR-302通過快速調節G1期限制點促進ESC細胞增殖，而抑制其分化[8]。在hESCs，miR-302a提高CyclinD1表達，從而加快G1期，延長S期[5]。p21是miR-302的已知報道的靶基因[9]。本實驗也發現，miR-302a mimics可使缺乏葉酸的mESC細胞CyclinD1表達量提高，p21和p27表達量下降，G1期縮短。

已有文獻報道，未分化狀態下hESCs的增殖與PI3K/Akt/mTOR的高磷酸化水平有關[10]。PI3K屬于磷脂酰肌醇依賴激酶家族，可通過一系列信號轉導以此激活Akt，而被描述為癌基因的Akt，參與了包括細胞增殖、細胞凋亡、遷移等在內許多基本的細胞過程。Akt活化后可以促進mTOR磷酸化，使其產生應答效應，調節下游通路，使與細胞周期有關的蛋白表達增加，促進細胞周期跨越G1期，影響細胞的生長及大小[11]。激活PI3K/Akt信號通路，可明顯抑制細胞凋亡，并下調G0/G1期比例，從而維持hESC的存活和增殖[12]。miR-302-367簇通過PI3K/Akt信號通路抑制膠質瘤細胞的增殖及轉移[13]。miR-302-367簇通過降低Akt1磷酸化水平，下調CyclinD1表達，上調p27及p21表達，從而抑制宮頸癌細胞增殖[9]。本研究也發現，miR-302a mimics能使缺乏葉酸的mESC中Akt和mTOR磷酸化水平提高，并抑制細胞凋亡。

綜上所述，在缺乏葉酸的mESC中miR-302a表達量下降，細胞凋亡增加，細胞周期阻滯在G1期，CyclinD1表達量下降，p21和p27表達量上升，Akt/mTOR磷酸化水平下降，當轉染miR-302a mimics后，細胞凋亡率下降，G1期縮短，CyclinD1表達量上升，p21和p27表達量下降，Akt/mTOR磷酸化水平提高，說明miR-302a可通過PI3K/Akt/mTOR信號通路來調節細胞增殖和凋亡。

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Effect of miR-302a on proliferation and apoptosis in folate deficient mouse embryonic stem cell

Yang Qian，Shi Wei△

(Department of Pediatrics,Sichuan Academy of Medical Sciences/SichuanProvincial People′s Hospital,Chengdu,Sichuan 610017,China)

[Abstract]ObjectiveTo explore effect of miR-302a on proliferation and apoptosis in folate deficiency mouse embryonic stem cell (mESC).MethodsThe cases were divided into complete culture medium group (control group),folate-deficient culture medium group (folate-deficient group),folate-deficient culture medium plus miR-302a mimic group (miR-302a group).The expression of miR-302a was examed by RT-PCR in control group and folate-deficient group.To construct miR-302a mimic and then was transfected into the folate-deficient culture medium mESC.Effect of miR-302a mimic on mESC viability was detected by MTT assay，the effect of miR-302a mimic on mESC apoptosis was examed by Annexin V-FITC/PI flow dual-staining method,the effect of miR-302a mimic on mESC cycle was examed by flow cytometry.The activation of phosphatidylinositol 3 kinase (PI3K)/protein kinase B (AKT)/mammalian target of rapamycin (mTOR) and expression of CyclinD1,p21 and p27 was assayed by Western blot.ResultsThe expression of miR-302a was lower in folate-deficient group(P<0.01).Compared with control group,the viability of mESC was lower,the apoptosis of mESC was higher,the cell cycle was arrested in G1 phase,the level of phosphorylation of AKT and mTOR was lower,the expression of CyclinD1 was lower,the expression of p21 and p27 was higher in folate-deficient group,with statistical significance (P<0.01).Compared with folate-deficient group,the viability of mESC was higher,the apoptosis of mESC was lower,G1 phase was shortened,the level of phosphorylation of AKT and mTOR was higher,the expression of CyclinD1 was higher,the expression of p21 and p27 was lower in miR-302a group with statistical significance (P<0.01).ConclusionThese results suggested miR-302a exerted anti-apoptosis and promote cell proliferation in folate-deficient culture medium,which might be related to PI3K/AKT/mTOR signal pathway.

[Key words]folic acid;mice;embryonic stem cells;proliferaion;apoptosis;miR-302a

doi:論著·基礎研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.11.011

作者簡介：陽倩(1976-),主治醫師，碩士,主要從事兒科新生兒學研究。△通訊作者，E-mail:shiw200888@126.com。

[中圖分類號]R363

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)11-1477-04

(收稿日期：2015-10-23修回日期：2015-12-20)