無創產前檢測的臨床應用及隨訪研究*

賴允麗，陳　筠，易　升,周　林，易　賞，雷亞琴，鄭海洋，林　飛，鄔玲仟，韋紅衛

(1.廣西壯族自治區婦幼保健院遺傳代謝中心實驗室，南寧 530000;2.山東省聊城市東昌府區婦幼保健院　252200;3.中南大學醫學遺傳學國家重點實驗室，長沙 410078;4.廣西壯族自治區婦幼保健院婦產科，南寧 530000)

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無創產前檢測的臨床應用及隨訪研究*

賴允麗1，陳筠1，易升1,周林2，易賞1，雷亞琴1，鄭海洋1，林飛1，鄔玲仟3▲，韋紅衛4△

(1.廣西壯族自治區婦幼保健院遺傳代謝中心實驗室，南寧 530000;2.山東省聊城市東昌府區婦幼保健院252200;3.中南大學醫學遺傳學國家重點實驗室，長沙 410078;4.廣西壯族自治區婦幼保健院婦產科，南寧 530000)

[摘要]目的采用大規模平行測序檢測胎兒染色體疾病，通過全面隨訪，為無創產前檢測(NIPT)的臨床應用提供有效的數據支持及遺傳咨詢方案。方法唐氏篩查高風險的孕婦接受NIPT，結果提示高危者進行核型確診，低危者進行生育前后隨訪。結果(1)NIPT提示胎兒異常25例，異常率為1.49%，核型確診異常12例，均已引產，NIPT對T21、T18、XO、XXY、XYY的準確性依次為99.93%、100.00%、99.66%、100.00%、100.00%；在高齡妊娠和雙胎妊娠中對T21/T18的準確性達100.00%；產前陽性干預率達100.00%。(2)NIPT提示低風險1 651例，完成隨訪1 468例，成功率為88.91%，發現1例9號染色體倒位(母源性)。(3)B超檢測染色體異常準確率達98.17%，檢出率僅7.69%；唐氏篩查高風險人群的準確率僅為0.88%，假陽性率高達99.12%；NIPT避免了98.71%的孕婦進行介入性產前診斷。結論NIPT作為現有產前檢測技術的重要補充，為尋找最合適的產前篩查模式提供參考。在醫療機構建立健全NIPT隨訪和服務系統對降低出生缺陷疾病尤為重要。

[關鍵詞]無創產前檢測；染色體疾?。怀暀z測；唐氏篩查高風險；隨訪研究

當前國際上最前沿的新一代DNA測序技術已在臨床中發揮巨大作用，其中NIPT能準確、安全、快速地檢測胎兒染色體非整倍體疾病，在國內外廣泛推廣和應用。國際上NIPT在高風險孕婦人群中檢測21三體綜合征(T21)，18三體綜合征(T18)、13三體綜合征(T13)的高度準確性和特異性得以高度的認可[1]。但多數文獻報道數據未能完成隨訪，缺乏后期異常病例發現的統計結果，極有可能造成信息的遺漏，全面的追蹤隨訪對提供有效的數據尤為重要，才能更深刻、更全面的對NIPT臨床應用進行評估，為建立NIPT適宜產前檢測模式具有十分重要價值和臨床指導意義，婦幼醫療機構將會在此扮演舉足輕重的作用。本文就此報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料2013年1月至2014年2月，廣西壯族自治區婦幼保健院進行NIPT孕婦1 676例，研究入選條件為：單雙胎，孕14周以上，均進行B超檢測，唐氏篩查高風險的孕婦人群，孕婦均簽署檢測知情同意書，孕周大于或等于24周的孕婦均被告知存在錯過最佳介入產前診斷時間而無法進行確診的風險，并簽署檢測知情同意書。

1.2方法

1.2.1中孕期唐氏血清學篩查采用PE公司的甲胎蛋白/游離hCGβ亞基雙標測定試劑盒(時間分辨熒光法)和游離雌三醇測定試劑盒(時間分辨熒光法)，針對AFP、游離hCGβ、游離uE3進行三聯篩查，按說明書進行實驗操作。T21高風險截斷值為1/270，T18高風險截斷值為1/350。

1.2.2二代測序采用EDTA抗凝管收集孕婦外周血5 mL，8 h內以4 ℃ 1 600 r、16 000 r速度依次進行血漿分離，每管600 μL分裝后-20 ℃保存。次日干冰運輸至深圳華大基因，采用Hiseq2000測序平臺進行單端36+8(index)bp測序。采用生物信息對數據進行分析，Z值評估患病風險率。

1.2.3染色體制備接種：臍血接種后培養68～72 h，羊水接種后培養8～10 d，放置37 ℃恒溫箱中。收獲：臍血培養液轉移至離心管后，采用自動化收獲儀收獲。羊水則滴加秋水酰胺，混勻后置于37 ℃培養箱中3 h。滴加2 mL 0.25%EDTA-胰酶，37 ℃消化10 min，1 500 r/min離心8 min，去上清。低滲：采用0.075 mol/L KCl在37 ℃水浴箱低滲4.5 min。預固定、固定：加入固定劑后1 800 r/min離心8 min，棄去上清(重復固定2次)。滴片：細胞懸液滴片。染色后掃片，進行核型分析。

2結果

2.1入選NIPT的孕婦基本信息1 676例中晚孕期(≥14周)孕婦進行B超檢測和唐氏篩查，唐氏篩查為高風險則選擇NIPT，包括雙胎妊娠25例，單胎妊娠1 651例；年齡17～47歲，平均29歲，高齡妊娠(≥35歲)264例(15.8%)，低齡妊娠1 412例(84.2%)；孕周14～34周，平均19.5周，見圖1、2。

B超提示：正常1 660例，異常16例，異常率為0.95%，主要表現為左心室強光斑、胎盤增厚、腎盂分離、腸管回聲增強、脈絡囊腫、股骨偏短、羊水偏多。唐氏篩查提示：21-三體高風險1 481例(88.37%)，18-三體高風險138例(8.23%)，21/18-三體高風險57例(3.4%)；此外，助孕生殖4例，Rh陰性血型1例，梅毒感染1例。見表1。

圖1　孕婦年齡分布特征

2.2NIPT技術評估

2.2.1NIPT與染色體非整倍體疾病NIPT結果提示：低風險1 651例，高風險25例(均為單胎)，異常率為1.49%。高風險包括7例T21，3例T18，5例XO，2例XXY，1例XYY，1例3號染色體偏多，1例9號染色體偏多，5例16號染色體偏多。25例高風險者均進行核型確診：陰性13例，陽性12例(6例T21，3例T18，0例XO，2例XXY，1例XYY)。確診陽性者均已引產，異常產前干預率達100%，確診陰性者則繼續妊娠。

1 651例NIPT低風險孕婦均進行生育前后隨訪，1 468例隨訪成功，183例隨訪失敗，隨訪成功率為88.91%；隨訪1 468例中，終止妊娠15例(9例流產，6例B超檢測異常引產)，均未做核型分析。其余1 453例孕婦分娩于37+1～42+2周，平均39+2周；1 453例出生胎兒中，健康狀態良好者1 382例，體檢異常者71例，異常率為4.89%。新生兒異常疾病以先天性耳聾、先天性心臟病、G6PD缺乏癥、地中海貧血為主，占3.23%，偶見甲狀腺功能亢進/低下及白化病患兒；亦可見畸形患兒如漏斗胸、畸形兒、缺指/并指等；4例頭腦發育遲緩和2例面容異常者經核型確診均未見異常；發現1例核型異常者，為9號染色體倒位，父母雙方驗證為母源性，表型正常；未發現T21/T18/T13異?；純撼錾?。

NIPT對T21、T18、XXY、XYY檢測具有較高準確性和高檢出率，準確性依次為99.93%、100.00%、100.00%、100.00%，檢出率均達100.00%；而NIPT對45,XO準確率達99.66%，檢出率低，并有0.34%假陽性率。NIPT對3號、9號、16號染色體偏多的檢測準確性不高。NIPT不能檢測染色體結構異常。見表2、3。

圖2　孕婦孕周分布特征

表1　入選NIPT的孕婦信息

表2　NIPT染色體異常與核型分析結果比較

表3　NIPT低風險的追蹤隨訪信息

2.2.2NIPT 與年齡、雙胎關系1 478例有效數據中，高齡妊娠(≥35歲)253例，低齡妊娠1 214例，NIPT檢測準確性分別為100.00%與99.51%。NIPT檢測雙胎與單胎的準確性依次為100.00%和99.59%，見表4。

表4　NIPT在高低齡和單雙胎人群中檢測染色體非整倍體的分析

-:無法計算。

2.3產前檢測技術比較1 478例(25例核型確診+1 453例有效隨訪)孕婦均進行B超檢測，提示正常1 462例，異常16例，核型確診/隨訪發現1例異常(染色體倒位)及12例陽性，B超準確性為98.17%，檢出率僅為7.69%；1 478例唐氏篩查高風險孕婦，核型確診/隨訪僅發現陽性13例，其余均為陰性，唐氏篩查高風險人群的準確率僅為0.88%，假陽性高達99.12%；NIPT對染色體異常疾病檢測準確性高達99.00%，檢出率達92.00%，具有較高特異性與靈敏性，有效避免了98.71%(1 459/1 478)的孕婦進行介入性產前診斷。見表5、6，圖3。

表5　不同檢測方法的結果

表6　染色體異常疾病的檢測方法比較

圖3　唐氏篩查與NIPT進行介入性產前診斷的比較分析

3討論

產前篩查、產前診斷是防止出生缺陷率的重要手段。近年來，NIPT在產前領域中取得了迅速的發展和應用。NIPT在唐氏高風險孕婦人群中檢測T21/T18/T13的準確性已在國際獲得高度認可，并應用于臨床檢測[2]。但多數文獻報道并未完成隨訪，缺乏后期異常病例的追蹤而造成信息的遺漏。因此，通過有效的隨訪數據，才能對NIPT進行更全面的評估，為尋找NIPT適宜檢測模式及給予正確的臨床指導尤為重要[3-4]。

本研究NIPT結果顯示：低風險1 651例，高風險25例，異常率為1.49%，與Sago等[5]在唐氏高風險人群的研究結果類似。其中染色體非整倍體異常18例，核型確診陽性12例并引產，干預率達100%，13例低風險經隨訪均未見異常。NIPT對T21、T18檢測準確率分別為99.93%、100%，檢出率達100%，與國際報道一致。發現1例T21假陽性，不排除孕婦異體輸血、移植手術、干細胞治療的可能。NIPT對性染色體XXY、XYY 檢測準確性和檢出率為100%，45,XO檢測準確性為99.66%，NIPT對性染色體檢出率低于常染色體，多認為和GC含量偏向性有關[6]，研究者[7]通過改進染色體內標參照方法，對數據進行GC修正，減小變異系數，一定程度上克服GC含量問題[8]。研究者利用胎兒特異性甲基化DNA比例差異分析，成功解決了這方面的局限性[9]。Yao等[10]對NIPT的性染色體檢測進行綜合評估，獲得Z<-2.5作為判斷XO的切值并給臨床遺傳咨詢帶來了幫助。

NIPT低風險的隨訪率為88.91%。1 468例中自然流產9例，因B超發現異常而終止妊娠6例，正常分娩1 453例。1 453例新生兒進行體檢，健康狀態良好者1 382例(包括孕婦為IVF、梅毒感染及陰性血型者)，異常者71例，異常率為4.89%。其中發現染色體異常1例，為9號染色體倒位，經父母驗證為母源性遺傳，表型正常。其余異常疾病以先天性耳聾、先天性心臟病、G6PD缺乏癥、地中海貧血疾病為主，分別占1.58%、0.69%、0.55%和0.41%，為廣西地區高發性疾病?？梢姡琋IPT適用于IVF助孕生殖、患感染疾病等孕婦人群；不能檢測染色體結構異常，與相關研究結果類似[11-13]；NIPT檢測3號、9號、6號染色體偏多者，提示T3/T9/T16或者復雜嵌合可能性大，僅作參考。

NIPT低風險人群，并不能完全排除異常妊娠[14-15]，而仍需利用B超及時發現先天性心臟病、畸形兒等異常。同時需結合廣西地區缺失缺陷疾病發病率，加強對耳聾基因、地中海貧血及單基因疾病的產前篩查/診斷工作，降低異?；純旱某錾?。此外，NIPT在產前領域中的應用已上升到道德倫理問題，異常的咨詢尤為關鍵[16]。日本Sago等[5]對全國整年的NIPT數據進行統計研究，提出全面有效的檢測/隨訪數據才能更好地服務于遺傳咨詢，婦幼保健系統需建立完善的隨訪體系，為NIPT的推廣應用非常重要。

NIPT對高齡妊娠檢測的準確性達100%，高于低齡妊娠99.51%，美國ACOG推薦NIPT的臨床適用高齡妊娠[13]。同時，NIPT對單/雙胎妊娠檢測準確性大于99.5%，大眾對NIPT在雙胎妊娠人群中的檢測具有極大興趣，仍未有大數據的研究報道[17]，準確性和靈敏度需要進一步的臨床驗證[18-20]。且本研究高齡、雙胎基數過少，僅供參考。

1 478例核型確診/隨訪成功者中，B超提示異常僅1例脈絡囊腫確診為T18，其余核型確診/隨訪未發現染色體非整倍體異常。B超檢查準確性98.17%，檢出率僅為7.69%。唐氏篩查高風險孕婦人群的準確率僅有0.88%，假陽性率高達99.12%。B超能了解胎兒生長、發育情況，對異常的流產、死胎、宮外孕、葡萄胎、畸形胎等畸變類型能做出診斷，胎盤嵌合(NIPT假陰性)、Turner綜合征等可通過B超發現異常[21]，但檢測易受儀器的分辨率和醫生檢測技術和經驗的影響，對指標不明確或者有爭議的發育異常無法判斷。傳統的血清學聯合篩查法假陽性率較高。本研究理論上避免了98.71%的孕婦進行介入性產前診斷。因此，NIPT以其近乎診斷的技術為產前診斷帶來了新的希望[22]。

有研究數據表明，26.7%的唐氏高風險孕婦選擇NIPT將減少25.6%的核型穿刺量。美國測序公司Ariosa統計近10萬例數據表明：NIPT以795美元收費標準，較早孕唐氏篩查和中孕唐氏篩查成本更經濟實惠[23]。比利時Neyt等[24]探索NIPT產前檢測模式，認為NIPT針對唐篩高風險人群的二線檢測和針對所有孕婦人群的一線檢測方法，均可降低因核型穿刺取樣所致的流產風險，前者是現今適宜方法，而后者則需較高成本而成為限制。因此，NIPT以更早、更精確的優勢作為現有檢測技術的重要補充，希望通過降低成本，鋪開應用。

通過本研究，廣西地區NIPT與產前檢測技術結合的檢測模式：唐氏篩查高風險、單雙胎、高齡妊娠、產前診斷禁忌的孕婦可建議在中孕期(≥14W)進行NIPT檢查，若檢測為染色體非整倍體高風險則必須進入產前診斷，低風險進行全面隨訪；NIPT可作為孕齡過大孕婦的補救措施，NIPT高風險者建議行介入性產前診斷，最大限度降低出生缺陷率；建立婦幼系統NIPT隨訪體系，做好全面隨訪和遺傳咨詢工作，隨訪中需考慮廣西重大出生缺陷疾病，發現異常者立即召回進行相關疾病的產前篩查/診斷。

隨著測序技術不斷進步，NIPT在染色體微缺失/重復[25]、雙胎妊娠、唐氏早期篩查[26-27]及單基因疾病[28-29]的檢測已成為可能。我們相信，通過技術的不斷優化，NIPT必將繼續給產前檢測領域帶來不可估量的價值。

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The clinical application and follow-up study of f non-invasive prenatal testing*

Lai Yunli1,Chen Yun1,Yi Sheng1,Zhou Lin2,Yi Shang1,Lei Yaqin1, Zheng Haiyang1,Lin Fei1,Wu Lingqian3▲,Wei Hongwei4△

(1.Genetic and Metabolic Center,Guangxi Maternal and Child Health Hospital,Nanning,Guangxi 530021,China;2.Maternal and Child Health Hospital of Dongchangfu District of Liaocheng City,Liaocheng,Shandong 252200,China;3.State Key Laboratory of Medical Genetics,Central South University,Changsha,Hunan 410078,China；4.Department of Obstetrics and Gynecology,Guangxi Maternal and Child Health Hospital,Nanning,Guangxi 530021,China)

[Abstract]ObjectiveTo provide valid data and useful genetic counseling in the clinical application of non-invasive prenatal test (NIPT),fetal chromosomal disorder were screened by massive parallel sequencing and made a follow-up study.MethodsPregnant women with Down screening in high-risk were screened by NIPT;NIPT verified high-risk individuals were suggested for karyotyping;and we follow up on whoever showed low risk by NIPT before and after their deliveries.Results(1)Totally 1 676 cases of pregnant women were tested by NIPT,25 cases prompted to be abnormal,with an abnormal rate of 1.49%,karyotype analysis results in 12 cases of abnormalit,the accuracies of NIPT for T21,T18,XO,XXY,and XYY were 99.93%,100.00%,99.66%,100.00%,100.00% respectively;the accuracy of NIPT for women with advanced paternal age and twins were both 100.00%;karyotyping positive individuals underwent abortion,which gives a prenatal intervention rate of 100.00%.(2)Out of 1 651 cases of NIPT low risk testers,1 468 cases were successfully followed up,with a 88.91% success rate.We found chromosome abnormality with one case of inversion of chromosome 9 (maternal).(3)Ultrasound-detection possessed 98.17% accuracy and 7.69% in detection rate;in high-risk pregnant woman,Down screening had an accuracy of 0.88% and false positive rate of 99.12%;98.71% women were avoided prenatal diagnosis via NIPT.ConclusionCompare to ultrasound and maternal plasma screening,NIPT is a far more accurate prenatal screening approach.To build effective follow-up and service systems of NIPT is necessary to reduce birth defects in medical institutions.

[Key words]non-invasive prenatal test;chromosomal abnormality;ultrasonic test;Down screening in high-risk;follow-up study

doi:論著·臨床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.11.015

* 基金項目：國家科技支撐計劃項目(2014BAI06B03)；廣西醫療衛生適宜技術研究與開發項目(S201543)。

作者簡介：賴允麗(1986-)，助理研究員，碩士，主要從事遺傳學分子診斷研究?！ㄓ嵶髡?，E-mail:laiyunlilyl@163.com?！魍ㄓ嵶髡?，E-mail:591795605@qq.com。

[中圖分類號]R714.55

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)11-1491-05

(收稿日期：2015-10-30修回日期：2015-12-25)