貴陽地區新生兒G6PD缺乏癥分子篩查結果分析*

黃盛文，吳　嫻，許　吟，周　曼，劉興梅

?

貴陽地區新生兒G6PD缺乏癥分子篩查結果分析*

黃盛文1，吳嫻1，許吟2，周曼2，劉興梅1

[摘要]目的了解貴陽地區葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)缺乏癥的發生率及基因突變分布情況。方法選取新生兒臍血DNA樣本515例，采用基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜系統檢測G6PD基因15種突變類型和1種多態位點。結果515份樣本檢出G6PD基因突變10例，檢出率為1.94%。檢出5種突變類型：1388G>A 4例(40.0%)，1024C>T和519C>T各2例(20.0%)，1376G>T和95A>G各1例(10.0%)。多態位點1311C>T的等位基因頻率為12.79%。結論貴陽地區是G6PD缺乏癥的高發區，1388G>A是該地區最常見的G6PD基因突變類型。

[關鍵詞]葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥；基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜；新生兒；分子篩查

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)缺乏癥是最常見的人類酶缺陷癥之一，全世界范圍內約有4億人受累[1]。我國長江以南地區是G6PD缺乏癥的高發區，人群中基因攜帶率為4%～20%[2]。G6PD缺乏癥是引起新生兒黃疸的主要原因之一，約50%的患兒有新生兒黃疸，嚴重者可發展為核黃疸，引起腦組織病理性損害，導致腦癱、智力低下等嚴重后遺癥[3]。因此，開展新生兒G6PD缺乏癥篩查，可指導臨床及早采取措施，預防新生兒高膽紅素血癥和核黃疸的發生。目前臨床上主要是通過直接或間接檢測G6PD活性的方法來進行G6PD缺乏癥的篩查。由于女性雜合子的酶活性變異程度較大，這些方法容易造成女性雜合子的漏檢。采用分子篩查的方法可提高雜合子的檢出率。為了解貴陽地區G6PD缺乏癥的發生率及基因突變分布情況，本研究采用基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)技術，對515例新生兒的G6PD基因突變進行分子篩查。

1資料與方法

1.1一般資料研究樣本來自于貴州省人民醫院分子生物室樣本庫，共515份新生兒臍血DNA樣本，其中男264例，女251例。

1.2方法

1.2.1突變位點及引物設計選取我國人群中已發現的3種常見突變位點(1388G>A、1376G>T、95A>G)，12種少見突變位點(1387C>T、1381G>A、1360C>T、1024C>T、1004C>A、871G>A、835A>G、592C>T、519C>T、517C>T、487G>A、392G>T)及1種常見多態位點(1311C>T)，采用AssayDesigner3.1軟件進行PCR引物和延伸引物設計，引物序列見表1。引物由上海英駿生物技術有限公司合成。

1.2.2PCR及引物延伸反應將樣本標化至10～20 ng/μL，按照384孔板配置試劑。每孔5 μL PCR反應體系含：10×PCR緩沖液0.5 μL，25 mmol/L MgCl20.4 μL，25 mmol/L dNTP Mix 0.1 μL，0.5 μmol/L Primer Mix 1 μL，5 U/μL HotStar Taq 0.2 μL，標化DNA 模板1 μL。循環參數：94 ℃預變性15 min，94 ℃20 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共45個循環；最后72 ℃延伸3 min。PCR產物中加入2 μL蝦堿性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase enzyme,SAP)消化液進行去磷酸化反應以去除未用完的dNTP。將配置好的iPLEX引物延伸反應混合液2 μL 加入已完成SAP反應的PCR產物中進行延伸反應。PCR反應和引物延伸反應均在ABI veriti 384孔PCR儀上進行。

1.2.3MALDI-TOF-MS檢測將完成全部反應過程的產物用樹脂進行脫鹽洗滌，再將檢測樣品從384孔板中轉移到表面覆蓋基質的MassARRAY芯片中，放入Sequenom質譜儀中進行檢測。根據質譜圖中的峰值確定每份樣本的基因型，導出基因分型數據。

表1　G6PD基因突變位點MALDI-TOF-MS檢測擴增引物和延伸引物

續表1　G6PD基因突變位點MALDI-TOF-MS檢測擴增引物和延伸引物

F：上游引物；R：下游引物；E：延伸引物。

2結果

2.1基因分型結果將導出的基因分型數據進行聚合分析，得到15個突變位點和1個多態位點的基因型散點圖，并判別出每個位點的基因型分布情況。16個位點的判讀成功率均在98.5%以上，總判讀成功率為99.4%(8 190/8 240)。

2.2分子篩查結果515份樣本中檢出G6PD基因突變10例(1.94%)，其中男性4例(1.52%)，女性6例(2.39%)，均為突變雜合子。共檢出5種突變類型：1388G>A 4例(40.0%)，1024C>T和519C>T各2例(20.0%)，1376G>T和95A>G各1例(10.0%)。多態位點1311C>T在男性中檢出半合子35例(13.26%)；女性中基因型CC、CT和TT例數分別為193例(76.89%)、53例(21.12%)和5例(1.99%)。該組樣本中1311C>T的等位基因頻率為12.79%。見表2。

表2　G6PD基因突變類型分布情況

3討論

G6PD缺乏癥患者臨床表現變化較大。多數患者，尤其是女性雜合子平時可無臨床癥狀。部分患者可表現為藥物、食物或感染誘發的急性溶血，慢性非球形細胞溶血性貧血，新生兒黃疸等嚴重的臨床癥狀。開展新生兒G6PD缺乏癥篩查，不僅可以及早采取措施，防止核黃疸的發生，同時，可使攜帶有致病基因的患兒及家長在患兒的成長過程中做好預防工作，減少各種感染機會，避免服用或食用可誘發急性溶血的藥物及食物[4]。

臨床上G6PD缺乏癥的篩查方法分為G6PD活性定性和定量檢測兩類。定性方法有高鐵血紅蛋白還原試驗、硝基四氮唑藍(NBT)紙片法、熒光斑點試驗；定量方法有NBT定量法、G6PD/6PGD比值法等。目前對新生兒G6PD缺乏癥篩查的流程通常是先進行G6PD活性定性檢測，陽性者再進行定量檢測，可提高篩查的敏感性和準確性。由于G6PD缺乏癥是一種X-連鎖不完全顯性遺傳，女性雜合子的G6PD活性差異較大。因此，采用G6PD活性檢測的方法容易造成表型輕微的女性雜合子漏診，而她們會將致病基因繼續傳給后代。近年來，隨著分子診斷方法的迅速發展和普及，多種新技術用于G6PD的分子篩查，如反向點雜交[5]、變性高效液相色譜[6]、熒光探針PCR熔解曲線法[7]、基因芯片[8]和飛行時間質譜[9]等，提高了女性雜合子的檢出率。

MALDI-TOF-MS是一種生物分子定性和定量分析的標準檢測方法[10]，結合引物延伸反應，已發展成為一種常用的單核苷酸多態性(SNP)和點突變檢測技術，廣泛用于分子診斷和多態與疾病易感性的關聯研究[11]。本研究采用MALDI-TOF-MS結合引物延伸技術，對新生兒進行G6PD基因突變篩查，包括15種突變位點和1種多態位點，涵蓋了我國人群中絕大部分的G6PD基因突變類型。由于我國人群中已發現的G6PD基因突變類型有30多種，本研究的方法不能檢測出其他少見和未知的突變類型。因此，在實際應用中，仍需要與G6PD活性檢測的方法相結合，對G6PD活性檢測陽性而分子篩查陰性的樣本，需要進一步做序列分析以明確。

本研究中G6PD的檢出率為1.94%，高于文獻報道的1.21%[12]，這是因為作者采用的是分子篩查方法，而文獻報道采用的是G6PD活性檢測，說明分子篩查的敏感性更高，降低了女性雜合子的漏檢率。國內最常見的3種G6PD基因突變類型，即1388G>A、1376G>T和95A>G[13]在本組樣本中均有檢出，但所占比例與其他地區有所不同。1388G>A所占比例最高，達40.0%，其次是1024C>T和519C>T，各占20.0%，而1376G>T和95A>G最低，分別占10.0%，說明不同地區不同人群的G6PD基因突變譜不同。1311C>T是不引起氨基酸改變的多態位點，在世界各地人群中分布廣泛。本組樣本中1311C>T的等位基因頻率為12.79%，顯著高于廣西地區的7.8%[14]，同樣也與不同地區和人群有關。這一位點的分型主要用于G6PD基因單倍型研究以確定不同突變發生的時間，對G6PD缺乏癥的致病性尚存在一定的爭議。

參考文獻

[1]Beutler E.G6PD:populmion genetics and clinical manifestations[J].Blood Rev,1996,10(1):45-52.

[2]蔡稔.葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥的分子流行病學及診斷[J].廣西醫學,2007,29(9):1373-1375.

[3]李旺,范歆,林彩娟,等.某地區新生兒葡萄糖-6-磷酸脫氫酶篩查結果分析[J].檢驗醫學與臨床,2013,10(18):2401-2402.

[4]韋永瓊,郭健玉.成都市新生兒葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥篩查分析[J].國際檢驗醫學雜志,2013,34(24):3366-3367.

[5]Li L,Zhou YQ,Xiao QZ,et al.Development and evaluation of a reverse dot blot assay for the simultaneous detection of six common Chinese G6PD mutations and one polymorphism[J].Blood Cells Mol Dis,2008,41(1):17-21.

[6]Wu G,Liang WH,Zhu J,et al.Rapid,simultaneous genotyping of 10 Southeast Asian glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency-causing mutations and a silent polymorphism by multiplex primer extension/denaturing HPLC assay[J].Clin Chem,2005,51(7):1288-1291.

[7]嚴提珍,鐘青燕,唐寧,等.多色探針熒光PCR熔解曲線法在G6PD基因突變檢測中的臨床應用評價[J].中華醫學遺傳學雜志,2014,31(2):156-162.

[8]Bang CY,Hong QL,Zhen SL.Rapid detection of common Chinese glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) mutations by microarray-based assay[J].Am J Hematol,2004,76(4):405-412.

[9]Zhao F,Ou XL,Xu CC,et al.Rapid detection of six common Chinese G6PD mutations by MALDI-TOF MS[J].Blood Cells Mol Dis,2004,32(2):315-318.

[10]Aebersold R,Mann M.Mass spectrometry-based proteomics[J].Nature,2003,422(6928):198-207.

[11]Tost J,Gut IG.Genotyping single nucleotide polymorphisms by MALDI mass spectrometry in clinical applications[J].Clin Bioc,2005,38(4):335-350.

[12]厲勇,楊明,菲肖琨.貴陽地區新生兒G6PD 酶篩查結果分析[J].中國實驗診斷學,2014,18(7):1171-1172.

[13]Mason PJ,Bautista JM,Gilsanz F.G6PD deficiency:the genotype-phenotype association[J].Blood Rev,2007,21(5):267-283.

[14]Yan T,Cai R,Mo O,et al.Incidence and complete molecular characterization of glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency in the Guangxi Zhuang autonomous region of southern China:description of four novel mutations[J].Haematologica,2006,91(10):1321-1328.

(貴州省人民醫院：1.檢驗科;2.產科，貴陽 550002)

Molecular neonatal screening for glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency in Guiyang region*

Huang Shengwen1,Wu Xian1,Xu Yin2,Zhou Man2,Liu Xingmei1

(1.Department of Clinical Laboratory;2.Department of Obstetrics,Guizhou ProvincialPeople′s Hospital,Guiyang,Guizhou 550002,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the prevalence of glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) deficiency and distribution of mutations in G6PD gene in Guiyang region.MethodsA total of 515 DNA samples taken from newborn umbilical cord blood were collected,15 mutations and one single nucleotide polymorphism in G6PD gene were detected by using of the Sequenom MassArray MALDI-TOF-MS system.ResultsAmong the 515 samples,10 were determined to have one of the G6PD gene mutations with a detection rate of 1.94%,5 mutation types were detected as follow:1388G>A accounted for 40.0% (4/10 cases),1024C>T and 519C>T accounted for 20.0% (2/10 cases) respectively,1376G>T and 95A>G accounted for 10.0% (1/10 cases) respectively.The single nucleotide polymorphism allele frequency of 1311C>T was 12.79%.ConclusionGuiyang is a region with higher prevalence of G6PD deficiency,1388 G>A is the most common mutation of G6PD gene in this region.

[Key words]glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency;desorption/ionization time of flight mass spectrometry;neonatus;molecular screening

doi:論著·臨床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.11.019

* 基金項目：貴州省國際科技合作項目(黔科合外G字[2011]7039)。

作者簡介：黃盛文(1971-)，主任醫師，主要從事遺傳病基因診斷研究。

[中圖分類號]R446.1

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)11-1505-03

(收稿日期：2015-10-21修回日期：2015-12-26)