miRNA-125b在鼻咽癌中的表達(dá)及與順鉑化療敏感性研究

龔軒民,孫永東

(1.四川醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，四川瀘州 646000；2.四川醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院耳鼻喉科，四川瀘州 646000)

?

miRNA-125b在鼻咽癌中的表達(dá)及與順鉑化療敏感性研究

龔軒民1,孫永東2△

(1.四川醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，四川瀘州 646000；2.四川醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院耳鼻喉科，四川瀘州 646000)

[摘要]目的探討微小RNA-125b(miRNA-125b)在鼻咽癌組織、血清中的表達(dá)及與順鉑化療敏感性的相關(guān)性。方法收集34例臨床確診鼻咽癌完整病例資料及組織和血清標(biāo)本，另取患者癌旁組織為組織對照，同時(shí)收集34例健康體檢者血清標(biāo)本為血清對照，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time qPCR)法檢測miRNA-125b在癌組織、癌旁組織、血清中的表達(dá)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果miRNA-125b在癌組織的表達(dá)顯著低于癌旁組織(P=0.006)，在鼻咽癌患者血清中的表達(dá)顯著低于健康體檢者(P=0.000)；miRNA-125b在患者癌組織與血清中的表達(dá)無相關(guān)性(r=0.112，P=0.528)。miRNA-125b在癌組織中的表達(dá)與病理分型、T分期、N分期有關(guān)(P<0.05)，在患者血清中的表達(dá)僅與N分期相關(guān)(P<0.05)。miRNA-125b在癌組織中表達(dá)與順鉑化療敏感性呈負(fù)性相關(guān)(P<0.05)，在患者血清中的表達(dá)與順鉑化療敏感性無明顯相關(guān)性(P>0.05)。結(jié)論miRNA-125b的低表達(dá)可能參與了鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展，對鼻咽癌診斷、分型、分級有一定意義，在癌組織中的表達(dá)水平可作為篩選順鉑化療方案的指標(biāo)之一。

[關(guān)鍵詞]微RNA-125b;鼻咽腫瘤;順鉑;化學(xué)療法；敏感性

鼻咽癌是鼻咽黏膜上皮腫瘤，惡性程度高，具有浸潤性強(qiáng)、易遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等特征，是頭頸部最為常見的惡性腫瘤。鼻咽癌對放、化療敏感，化療方案首選順鉑(DDP)+5-氟尿嘧啶(5-FU)[1]，但是臨床治療過程中存在部分患者對化療耐藥的現(xiàn)象，給最佳化療方案的選擇帶來一定盲目性。鼻咽癌的發(fā)生被認(rèn)為與微小RNA(microRNA，miRNA)表達(dá)失衡有關(guān)，有研究證實(shí)miRNA-144在鼻咽癌組織中高表達(dá)[2]，miRNA-204在鼻咽癌組織中低表達(dá)[3]，這些現(xiàn)象可能會促進(jìn)鼻咽癌侵襲和轉(zhuǎn)移。miRNA-125b表達(dá)異常可能與腫瘤體積、侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)[4]，并且miRNA-125b可能通過對靶基因調(diào)控來影響腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性[5]。但是鼻咽癌患者miRNA-125b有無異常表達(dá)，目前還少見報(bào)道。本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time qPCR)法檢測鼻咽癌患者癌組織與血清miRNA-125b的表達(dá)，初步探討miRNA-125b與鼻咽癌發(fā)病的關(guān)系，以及對順鉑化療敏感性的影響。

1資料與方法

1.1一般資料選取四川醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院2012～2014年34例鼻咽癌患者為觀察組，其中男29例，女5例，年齡34～67歲，中位年齡54歲。在患者化療前收集癌組織、血清標(biāo)本。同時(shí)取患者癌旁組織(距腫瘤邊緣大于3 cm，經(jīng)病理證實(shí)為正常黏膜組織)，選擇同期健康體檢者34例血清為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)全部病例均經(jīng)電子鼻咽鏡取得組織活檢，經(jīng)病理確診為原發(fā)性鼻咽癌；(2)具備完整的臨床診斷、治療資料；(3)均經(jīng)過DDP化療，3個(gè)療程或以上，具備化療效果比較；(4)患者無嚴(yán)重心、肝、腎、肺等全身性疾病，家屬及患者知曉本研究過程、目的、意義，并同意參與。主要試劑與儀器：總RNA提取試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(北京艾德萊生物)，血清RNA提取試劑盒(Applied Biosyste，美國)，引物設(shè)計(jì)與合成(上海生物工程公司)，ABI-7300定量熒光PCR儀(ABI公司，美國)。

1.2方法氯仿提取法提取組織總RNA，mirVana miRNA Isolation試劑盒提取血清總RNA，以分光光度儀檢測260/280吸光度(OD)值。cDNA合成：取1 μg總RNA于20 μL反應(yīng)體系為4.00 μL 5×RT緩沖液，0.75 μL 10 mmol/L dNTP，2.00 μL 25 mmol /L Mg2+，0.25 μL 40 U/μL RNA酶抑制劑，0.20 μL 200 U/μL逆轉(zhuǎn)錄酶，其余以dd H2O補(bǔ)足，反應(yīng)條件為16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，75 ℃ 15 min。real-time-qPCR：以U6為內(nèi)參檢測目的基因相對表達(dá)量，U6、miRNA-125b引物序列見表1，反應(yīng)總體積為20 μL為2×miRNA qPCR Mix(含Sybr Green) 10 μL、反向引物0.4 μL、正向引物0.4 μL、cDNA產(chǎn)物1.0 μL、其余用dd H2O補(bǔ)齊，反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃ 20 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 40 s，共40個(gè)循環(huán);所有反應(yīng)設(shè)立3個(gè)復(fù)孔。得到Ct值，Ct值代表熒光達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)。

表1　引物序列

1.3順鉑化療敏感性判定采用國際抗癌聯(lián)盟實(shí)體腫瘤客觀療效標(biāo)準(zhǔn)。完全緩解(CR)：腫瘤完全消失，持續(xù)1個(gè)月以上；部分緩解(PR)：病灶最大橫徑與最大垂直徑乘積縮小50%以上，持續(xù)1個(gè)月以上；疾病穩(wěn)定(SD)：病灶兩徑乘積縮小不足50%，增大不超過 25%，持續(xù)1個(gè)月；進(jìn)展(PD)：病灶兩徑乘積增大25%以上或有新病灶出現(xiàn)。高敏感組為CR+PR，低敏感組為SD+PD。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用中位數(shù)及四分位數(shù)(P25～P75)表示，配對樣本中目的基因miRNA-125b相對表達(dá)量采用2-△Ct，△Ct=CtmiRNA-125b-Ct U6，表示目的基因相對于內(nèi)參基因表達(dá)量，獨(dú)立樣本中miRNA-125b的相對表達(dá)量2-△△Ct[6]，△△Ct=△Ct觀察組-△Ct對照組，表示觀察組相對于對照組目的基因表達(dá)量；癌組織與癌旁組織、患者血清與對照組血清miRNA-125b表達(dá)量比較采用秩和檢驗(yàn)，癌組織、血清miRNA-125b相對表達(dá)量與臨床指標(biāo)、順鉑化療敏感性關(guān)系，采用Mann Whitney U檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組miRNA-125b表達(dá)比較觀察組患者癌組織中miRNA-125b表達(dá)量2-△Ct為7.62(4.26～13.91)，癌旁組織表達(dá)量2-△Ct為10.38(6.53～17.27)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.744，P=0.006)。觀察組患者血清中miRNA-125b表達(dá)量2-△Ct為5.64(2.78～8.49)，對照組血清miRNA-125b表達(dá)量2-△Ct為9.16(6.34～14.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-3.992，P=0.000)。見圖1。

圖1　各組miRNA-125b相對表達(dá)量的比較

2.2觀察組患者癌組織與血清miRNA-125b表達(dá)相關(guān)性分析癌組織miRNA-125b相對表達(dá)量2-△△Ct為0.685(0.436～0.825)，血清miRNA-125b相對表達(dá)量2-△△Ct為0.569(0.407～0.705)。鼻咽癌患者癌組織與血清miRNA-125b表達(dá)不存在相關(guān)性(r=0.112，P=0.528),見圖2。

圖2　觀察組癌組織、血清miRNA-125b表達(dá)的相關(guān)性

2.3鼻咽癌患者miRNA-125b表達(dá)水平與臨床指標(biāo)間的關(guān)系根據(jù)鼻咽癌患者性別、年齡、病理分型、T分期、N分期進(jìn)行分組，分析癌組織、血清miRNA-125b表達(dá)與臨床指標(biāo)的關(guān)系。結(jié)果顯示鼻咽癌組織miRNA-125b相對表達(dá)量2-△△Ct與性別、年齡無關(guān)，N+較N-分期表達(dá)顯著降低(P=0.000)；在病理分型的比較中，低、未分化型明顯低于中、高分化型(P=0.027)；T3～4期明顯低于T1～2期(P=0.016)。血清miRNA-125b相對表達(dá)量2-△△C與性別、年齡、T分期、病理分型無關(guān)，僅與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(N+表達(dá)量明顯低于N-，P=0.031)，見表2。

2.4鼻咽癌患者miRNA-125b表達(dá)與順鉑化療敏感性關(guān)系化療高敏感組鼻咽癌組織miRNA-125b相對表達(dá)量2-△△Ct為0.712(0.569～0.847)，低敏感組為0.558(0.418～0.705)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.572，P=0.010)。化療高敏感組血清miRNA-125b相對表達(dá)量2-△△Ct為0.553(0.403～0.746)，低敏感組為0.571(0.401～0.712)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-0.782，P=0.429)，見表3、圖3。

表2　鼻咽癌患者癌組織、血清miRNA-125b的表達(dá)與臨床指標(biāo)間的關(guān)系(n=34)

表3　鼻咽癌患者miRNA-125b表達(dá)與順鉑化療敏感性的關(guān)系

A:癌組織；B:血清。

圖3鼻咽癌患者miRNA-125b表達(dá)與順鉑化療敏感性的關(guān)系

3討論

miRNA是一類進(jìn)化保守的單鏈非編碼RNA，長度為20～22個(gè)核苷酸。miRNA可以通過與靶mRNA的3′非翻譯區(qū)結(jié)合，抑制其翻譯或者導(dǎo)致序列特異性靶mRNA降解，從而使基因沉默來發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、分化的生物學(xué)活性[7]。隨著人類基因圖譜的完善，通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，僅僅占人類基因組不到3%的miRNA可能參與了30%左右的人類基因調(diào)控[8]，超過50%的miRNA位于腫瘤相關(guān)基因區(qū)域內(nèi)。研究證實(shí)在人類多種惡性腫瘤組織中出現(xiàn)miRNA異常表達(dá)的現(xiàn)象[4,9]，提示某些miRNA可能作為癌基因或者抑癌基因在惡性腫瘤的發(fā)生過程中扮演核心角色。鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，EB病毒感染被認(rèn)為是重要原因之一，但新近研究發(fā)現(xiàn)和miRNA表達(dá)失衡也有密切聯(lián)系[2]。Sengupta等[10]揭示了鼻咽癌組織miRNA 表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)miRNA-29c、miRNA-212等8個(gè)miRNA 有較明顯的表達(dá)改變。miRNA-144、miRNA-204表達(dá)異常也被認(rèn)為與鼻咽癌發(fā)病有關(guān)[2-3]。提示miRNA在鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展過程中可能發(fā)揮了重要作用。miRNA-125b是miRNA家族較為活躍的成員，可能對腫瘤發(fā)生起著調(diào)控作用，與分化、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等諸多腫瘤細(xì)胞生物學(xué)活性相關(guān)[4,11-12]。據(jù)報(bào)道，miRNA-125b作為抑癌基因表達(dá)于肺癌[4]、肝癌[11]等癌組織中，作為癌基因表達(dá)于前列腺癌、胰腺癌[12]等癌組織中。但是在鼻咽癌組織中有無表達(dá)異常，還少見報(bào)道。本研究采用real time-qPCR分析鼻咽癌組織和癌旁組織miRNA-125b表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)癌組織miRNA-125b較癌旁組織表達(dá)明顯降低(P=0.006)。提示miRNA-125b可能作為抑癌基因存在于鼻黏膜組織，其表達(dá)降低可能使得相關(guān)癌基因激活，從而參與到鼻咽癌的發(fā)生。

外周循環(huán)血miRNA穩(wěn)定性高，不易被降解。研究顯示，循環(huán)血miRNA對腫瘤早期診斷、分期、預(yù)后有一定預(yù)見作用[13]。熊偉明[14]通過miRNA芯片篩選鼻咽癌患者外周血清中表達(dá)異常的miRNA，發(fā)現(xiàn)有miRNA-296、miRNA-361等76個(gè)較健康志愿者高表達(dá)，miRNA-125b、miRNA-487b等104個(gè)較低表達(dá)。但是此研究僅進(jìn)行了miRNA-125b的篩選，并沒有進(jìn)行驗(yàn)證檢測。本研究通過檢測血清中miRNA-125b水平發(fā)現(xiàn)，與健康體檢者比較，鼻咽癌患者miRNA-125b表達(dá)明顯降低(P=0.000)，與癌組織的檢測結(jié)果相符合。但二者表達(dá)并無相關(guān)性，可能是由于樣本量較少，缺乏大樣本量的比對數(shù)據(jù)所致。

本研究進(jìn)一步分析了miRNA-125b表達(dá)與臨床指標(biāo)間的關(guān)系。鼻咽癌組織中miRNA-125b表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分型、T分期顯著相關(guān)(P<0.05)。在血清中，miRNA-125b表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)。提示miRNA-125b可能參與了鼻咽癌的發(fā)展、轉(zhuǎn)移、侵襲。表明miRNA-125b作為抑癌基因與腫瘤細(xì)胞生物學(xué)活性、腫瘤進(jìn)程密切相關(guān)[15-16]。聯(lián)合檢測鼻咽癌組織和血清miRNA-125b表達(dá)可能對臨床分期、分級有一定幫助。

miRNA-125b可以通過對Bap1、Bbc3、Neu1、Bcl2、Stard13等靶基因的調(diào)控來影響腫瘤細(xì)胞對化學(xué)治療藥物耐藥[5]。Duroux-Richard等[17]發(fā)現(xiàn)在血清中miRNA-125b水平可以作為抗腫瘤藥物利妥昔單抗使用的生物學(xué)指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，對順鉑低敏感組患者鼻咽癌組織miRNA-125b表達(dá)要低于高敏感組(P=0.010)，而血清中表達(dá)無差異。表明在未使用化療藥物時(shí)癌組織miRNA-125b表達(dá)與順鉑化療敏感性呈一定負(fù)相關(guān)。但是據(jù)Chen等[18]的最新報(bào)道，采用順鉑治療的鼻咽癌患者miRNA-125b表達(dá)量會增加，反而降低了化療敏感性。但本研究分析的檢測指標(biāo)均來自未進(jìn)行化療的患者，二者研究對象有差異。同時(shí)這也說明鼻咽癌涉及miRNA-125b對順鉑耐藥的機(jī)制十分復(fù)雜，需要進(jìn)一步探索，尤其是在分子水平對上下游通路進(jìn)行研究。

綜上所述，miRNA-125b可能作為抑癌基因在鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起到重要作用，其表達(dá)變化可以反映鼻咽癌分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期等腫瘤進(jìn)展程度。miRNA-125b有望成為鼻咽癌患者順鉑化療的篩選指標(biāo)，為化療方案選擇提供依據(jù)。但是本研究依然存在樣本量少、缺乏相關(guān)分子機(jī)制研究作為支撐的局限，后續(xù)應(yīng)該加強(qiáng)和相關(guān)研究機(jī)構(gòu)的合作，進(jìn)行大樣本量實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探索miRNA-125b和鼻咽癌的關(guān)系，為鼻咽癌的診斷、治療提供新思路。

參考文獻(xiàn)

[1]Kong F,Cai B,Lin S,et al.Assessment of radiotherapy combined with adjuvant chemotherapy in the treatment of patients with advanced nasopharyngeal carcinoma:a prospective study[J].J BUON,2015,20(1):206-211.

[2]Zhang LY,Ho-Fun Lee V,Wong AM,et al.MicroRNA-144 promotes cell proliferation,migration and invasion in nasopharyngeal carcinoma through repression of PTEN[J].Carcinogenesis,2013,34(2):454-463.

[3]Peng T,Zhou X,Hu M,et al.Clinical significance of miRNA-204 in nasopharyngeal carcinoma[J].Lin Chung Er Bi Yan Hou Tou Jing Wai Ke Za Zhi,2014,28(22):1780-1782.

[4]Zhu WY,Luo B,Zhang YK,et al.Differential expression of miR-125a-5p and let-7e predicts the progression and prognosis of non-small cell lung cancer[J].Cancer Invest,2014,32(8):394-401.

[5]Bera A,VenkataSubbaRao K,Manoharan MS,et al.A miRNA signature of chemoresistant mesenchymal phenotype identifies novel molecular targets associated with advanced pancreatic cancer[J].PLoS One,2014,9(9):e106343.

[6]姜訓(xùn)圳，趙科，何向輝.miRNA-21、miRNA-135b、miRNA-141在結(jié)腸癌中的表達(dá)及其意義[J].中國普通外科雜志，2014，23(10):1367-1372.

[7]Yuan Y,Kasar S,Underbayev C,et al.MicroRNAs in acute myeloid leukemia and other blood disorders[J].Leuk Res Treatment,2012,2012:603830.

[8]Bartel DP.MicroRNAs:target recognition and regulatory functions[J].Cell,2009,136(2):215-233.

[9]LeBlanc VC,Morin P.Exploring miRNA-associated signatures with diagnostic relevance in glioblastoma multiforme and breast cancer patients[J].J Clin Med,2015,4(8):1612-1630.

[10]Sengupta S,den Boon JA,Chen IH,et al.MicroRNA 29c is down-regulated in nasopharyngeal carcinomas,up-regulating mRNAs encoding extracellular matrix proteins[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2008,105(15):5874-5878.

[11]Bi Q,Tang S,Fan D,et al.Ectopic expression of MiR-125a inhibits the proliferation and metastasis of hepatocellular carcinoma by targeting MMP11 and VEGF[J].PLoS One,2012,7(6):e40169.

[12]Bloomston M,Frankel WL,Croce CM,et al.MicroRNA expression patterns to differentiate pancreatic adenocarcinoma from normal pancreas and chronic pancreatitis[J].JAMA,2007,297(17):1901-1908.

[13]Nugent M,Miller N,Kerin MJ.Circulating miR-34a levels are reduced in colorectal cancer[J].J Surg Oncol,2012,106(8):947-952.

[14]熊偉明.鼻咽癌特異性血清miRNA 篩選與鑒定[D].桂林:桂林醫(yī)學(xué)院，2013.

[15]Liang L,Wong CM,Ying Q,et al.MicroRNA-125b suppressesed human liver cancer cell proliferation and metastasis by directly targeting oncogene LIN28B2[J].Hepatology,2010,52(5):1731-1740.

[16]Zhang Y,Yan LX,Wu QN,et al.miR-125b is methylated and functions as a tumor suppressor by regulating the ETS1 proto-oncogene in human invasive breast cancer[J].Cancer Res,2011,71(10):3552-3562.

[17]Duroux-Richard I,Pers YM,Fabre S,et al.Circulating miRNA-125b is a potential biomarker predicting response to rituximab in rheumatoid arthritis[J].Mediators Inflamm,2014,2014:342524.

[18]Chen JJ,Liu SX,Chen MZ,et al.Has-miR-125a and 125b are induced by treatment with cisplatin in nasopharyngeal carcinoma and inhibit apoptosis in a p53?dependent manner by targeting p53 mRNA[J].Mol Med Rep,2015,12(3):3569-3574.

Study on expression of miRNA-125b in nasopharyngeal carcinoma and sensitivity of cisplatin chemotherapy

Gong Xuanmin1,Sun Yongdong2△

(1.College of Traditional Chinese and Western Medicine，Sichuan Medical University,Luzhou, Sichuan 646000,China;2.Department of Otolaryngology,Affiliated Hospital of TraditionalChinese Medicine,Sichuan Medical University,Luzhou,Sichuan 646000,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the whether miR-125b expression having the abnormality in nasopharyngeal carcinoma tissues and serum and whether having the correlation with the sensitivity of cisplatin chemotherapy.MethodsThe intact medical records and tissue and serum samples in 34 cases of clinically diagnosed nasopharyngeal carcinoma were collected and the serum samples in 34 individuals undergoing the physical examination were also collected as the controls.The expression of miRNA-125b in carcinoma tissue,paracancerous tissue and serum was detected by real-time quantitative polymerase chain reaction (real-time qPCR).The statistical analysis was performed.ResultsThe expression of miRNA-125b in carcinoma tissue was significantly lower than that in paracancerous tissue(P=0.006),and serum miRNA-125b expression in nasopharyngeal carcinoma patients was significantly lower than that in the individuals undergoing the healthy physical examination(P=0.000);but the miRNA-125b expression had no correlation between the paracancerous tissue and serum(r=0.112，P=0.528).The expression of miRNA-125b in cancer tissues was correlated with the pathological typing,T staging and N staging(P<0.05),the serum miRNA-125b expression in carcinoma subjects was only related with the N staging (P<0.05).The expression of miRNA-125b in carcinoma tissue was negatively correlated with the sensitivity of cisplatin chemotherapy (P<0.05),however,there was no obvious correlation between the serum miRNA-125b level and the sensitivity of cisplatin chemotherapy (P>0.05).ConclusionThe low miRNA-125b expression may be involved in the occurrence and development of nasopharyngeal carcinoma and plays a certain significance for the diagnosis,pathology typing and classification of nasopharyngeal carcinoma.Its expression level in cancer tissue can serve as one of indicators for screening out the cisplatin chemotherapy sche

[Key words]microRNA-125b;nasopharyngeal neoplasms;cisplatin；chemotherapy;sensitivity

doi:論著·臨床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.11.022

作者簡介：龔軒民(1986-)，住院醫(yī)師，在讀碩士，主要從事鼻咽癌發(fā)病機(jī)制和中西醫(yī)結(jié)合治療的研究。△通訊作者，E-mail:sunyongd@126.com。

[中圖分類號]R739.63

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)11-1515-04

(收稿日期：2015-12-18修回日期：2016-02-06)