OPN干預子宮內膜異位癥腺上皮細胞中NF-κBp65表達及其對細胞侵襲性的影響*

白治苗，盧玉鳳，楊　眉，李望舒，哈春芳

(1.寧夏醫科大學，銀川 750004；2.寧夏醫科大學總醫院婦產科/寧夏生育力保持重點實驗室，銀川 750004)

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OPN干預子宮內膜異位癥腺上皮細胞中NF-κBp65表達及其對細胞侵襲性的影響*

白治苗1，盧玉鳳1，楊眉1，李望舒1，哈春芳2△

(1.寧夏醫科大學，銀川 750004；2.寧夏醫科大學總醫院婦產科/寧夏生育力保持重點實驗室，銀川 750004)

[摘要]目的探討子宮內膜異位癥(EMS)患者在位內膜腺上皮細胞中骨橋蛋白(OPN)對核因子κB(NF-κB)p65表達的影響及其與細胞侵襲的關系。方法原代分離培養12例EMS患者在位內膜原代腺上皮細胞。采用OPN siRNA干擾細胞24 h后收集，Western blot、RT-PCR方法分別檢測干預前、后細胞中OPN、NF-κBp65蛋白及其mRNA表達情況；Transwell試驗檢測干預前、后細胞侵襲性的變化。采用相同劑量的無RNA酶水干預EMS患者在位內膜腺上皮細胞作為未干預組。結果與干預前比較，OPN siRNA干擾后細胞中OPN蛋白、mRNA的表達明顯下降(t1=7.92，t2=9.87，P<0.05)；與未干預組比較差異無統計學意義(P>0.05)；OPN siRNA干擾后細胞中NF-κBp65蛋白及mRNA的表達明顯減弱(t1=-2.13,t2=- 8.61,P<0.05)，與未干預組比較差異無統計學意義(P>0.05)。OPN siRNA干擾后原代腺上皮細胞的侵襲性明顯降低(t=2.38,P<0.05)，與未干預組比較差異無統計學意義(P>0.05)。OPN、NF-κBp65在EMS患者在位內膜腺上皮細胞中的表達呈明顯的正相關(r=0.87)。結論OPN siRNA沉默EMS患者腺上皮細胞中的OPN后OPN、NF-κBp65的表達及細胞的侵襲性均明顯降低，且二者呈明顯正相關，揭示二者極有可能在異位細胞的侵襲中發揮同步協調作用。

[關鍵詞]子宮內膜異位癥；骨橋蛋白質；核因子-κBp65

子宮內膜異位癥(endometriosis，EMS)簡稱內異癥，是指具有活性的子宮內膜組織(腺體和間質)出現于子宮內膜以外的部位，導致臨床上常見的痛經或慢性盆腔痛、不孕等為主要臨床癥狀的疾病，目前病因及發生機制尚不十分明了，因而臨床缺乏有效的根治性治療方法，是婦科醫生亟待解決的難題之一[1-2]。基礎和臨床研究顯示EMS是一種子宮內膜活性增高所致的內膜異常性基因疾病，與內膜細胞的異地黏附和侵襲性增強有關[3]。EMS的黏附、侵襲、遠處轉移及術后易復發等特性類似于惡性腫瘤。腫瘤學研究顯示，骨橋蛋白(osteopontin，OPN)通過與其受體結合后激活依賴MAPK/PI3K通路的核因子-κB(NF-κB)通路，進而促進細胞中尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)和基質金屬蛋白酶9(MMPs)的分泌,介導細胞侵襲過程與細胞遷移，進而誘導腫瘤的發生與轉移[4]。因此國內外很多學者將血管生長因子或黏附分子OPN、MMP9及NF-κB等與EMS的發生、發展聯系起來，并揭示了這些因子可能與內膜的異位黏附、侵襲性相關[5-6]。但二者的相關性及其與細胞侵襲性的確切機制不清。故本研究旨在通過OPN siRNA干擾原代腺上皮細胞探討OPN、NF-κBp65與EMS發病及細胞侵襲性的關系。

1資料與方法

1.1一般資料

1.1.1標本獲取收集2013年12月至2014年12月于寧夏醫科大學總醫院婦產科因EMS行子宮全切術患者12例，用棉拭子將宮腔內的黏液蘸掉，用手術刀的刀背刮取內膜，快速于低溫下轉移至細胞間,進行原代細胞分離培養。

1.1.2納入標準所有研究對象的年齡20～45歲，平均(32.41±5.43)歲，患者手術前月經周期均正常(28～35 d)，均處于Ⅱ期(按照1985年AFS提出的修正EMS分期法)，近3個月均未接受過激素類藥物的治療，無生殖道炎癥及其他婦科疾病，無慢性肝炎、糖尿病、腫瘤等慢性疾病史。

1.2方法

1.2.1原代腺上皮細胞培養選取EMS患者行子宮全切術術后的子宮，術后用棉拭子蘸除黏液，手術刀刀背刮取內膜，置于含10 mL培養液的滅菌小瓶中，內含1%胎牛血清、DMED/F12(Penicillin及鏈霉素各100 U/mL)，冰浴快速轉運至實驗室細胞間,用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗掉新鮮的子宮內膜組織中的血液成分，用眼科剪將內膜剪成約1 mm3大小的組織塊，加入含有0.25%膠原酶/dispase(終濃度為1 mg/mL)的培養液中，于37 ℃用一次性吸管吹打消化3次，每次10 min，加入含血清的培養液終止消化，500 r/30 s離心，取上清液重復離心5次，沉淀中加入培養液，制成細胞懸液。細胞計數后，均勻將細胞接種于60 mm培養皿中，置于37 ℃ 5%CO2細胞培養箱中培養。

1.2.2OPN siRNA干擾待上述原代細胞融合度為70%～90%時，進行siRNA干擾。分別用500 μL Opti-MEM無血清培養基稀釋10 μL TransLipid HL,500 μL Opti-MEM無血清培養基稀釋10 μL OPN特異性siRNA及干擾siRNA(稀釋前的siRNA濃度20 μM),于室溫靜置5 min后，將稀釋好的OPN特異性siRNA(OPN siRNA干預組)及干擾siRNA(siRNA干預組)與TransLipid HL輕柔混合后室溫靜置20 min后，將混合物分別加入含5 mL Opti-MEM無血清培養液的60 mm培養皿中，其中一組加入相同劑量無RNA酶水干預的培養液作為空白對照組(未干預組)。放入培養箱中培養4～6 h后更換培養液繼續培養24 h。

1.2.3RT-PCR總RNA的提取直接在60 mm培養皿中加入600 μL裂解液RZ裂解細胞并反復抽打至溶液透明，將勻漿樣品室溫放置5 min，加入150 μL氯仿，劇烈震蕩15 s后室溫放置3 min，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，將水相轉移至新的Ep中。加入150 μL無水乙醇，混勻后將溶液轉入吸附柱CR3中，再次離心，棄掉收集管中的廢液，向吸附柱CR3中加入500 μL去蛋白液RD，離心，棄廢液，將CR3放回收集管中，再次向吸附柱CR3中加入500 μL漂洗液RW，室溫靜置2 min，離心，棄廢液，將吸附柱放入2 mL收集管中，離心去掉殘余液體，最后將吸附柱CR3轉入一個新的1.5 mL離心管中，加30 μL無酶的雙蒸水，室溫放置2 min，4 ℃ 12 000 r/min離心2 min后于BioTek ELx808酶標儀上行RNA純度及濃度的測定。

1.2.4Western blot檢測按照凱基蛋白質說明書提取試劑盒提取細胞總蛋白，并于酶標儀中進行蛋白定量。根據待測蛋白分子的大小制備適宜濃度的SDS分離膠及濃縮膠，插入相應大小的梳子，加入相應分組中蛋白樣品及標準蛋白標志物，電泳分離蛋白質后，轉運蛋白于硝酸纖維素膜；載有蛋白的硝酸纖維素膜經5% 脫脂牛奶封閉后，加入NF-κBp65、OPN及內參照β-actin等一抗4 ℃過夜，經TBST換洗1次(5 min),5次后加相應二抗孵育2 h，增強型ECL顯影，于BIO-RAD成像儀中曝光成像并測定各蛋白條帶光密度值，計算相應的光密度比值。

1.2.5穿膜實驗(transwell)待預先培養于60 mm培養皿中的EMS原代腺上皮細胞以及OPN siRNA干擾24 h后的細胞融合至80%～90%時，用0.25%的胰酶將其消化，采用無血清培養液將其制成細胞懸液，用一次性吸管吸取1滴進行細胞計數后，將懸液加入小室中(細胞數目大約為105)，于小室的下室中加入有血清的培養液后置于37 ℃，5%CO2的細胞培養箱中培養24 h，洗掉培養液，用棉拭子將小室正面的細胞輕輕擦掉后PBS沖洗2～3次，用無水乙醇固定30 min后PBS沖洗2～3次，0.4%臺盼藍染色10 min后，將小室的膜固定于載玻片上在顯微鏡下進行細胞計數。

1.2.6結果判定標準(1)Western blot結果分析：采用BIO-RAD成像儀掃描滴加DAB顯色劑后的蛋白條帶，成像并保存圖片，采用軟件Quality One進行灰度值掃描。(2)RT-PCR結果分析：用BIO-RAD凝膠掃描系統分析攝像，用Roche-Lightcycler 96對產物進行半定量分析。(3)Transwell結果：0.4%臺盼藍染色10 min后，將小室膜刮下貼于載玻片上，滴加二甲苯，蓋上蓋玻片封片，置于Leica DC 300F正置顯微鏡下固定選取16個視野于10倍鏡下進行細胞計數。

1.3主要試劑OPN siRNA、干擾siRNA(上海Invitrogen貿易有限公司)；TransLipid HL Transfection Reagent(北京全式金生物技術有限公司)；細胞全RNA提取試劑盒(上海田根有限公司)；RNA反轉錄試劑盒(Thermol公司)；免疫熒光定量試劑盒(Thermol公司)；兔抗人NF-κBp65、OPN多克隆抗體分別由北京中杉生物工程公司、美國Abcam生物公司生產(稀釋濃度分別為1∶100、1∶80)。

2結果

2.1OPN siRNA干擾前后OPN、NF-κBp65蛋白表達比較與siRNA干預組比較，OPN siRNA干擾EMS患者在位內膜腺上皮細胞后OPN蛋白及mRNA明顯下降(OPN蛋白3.10±0.26 vs. 0.40±0.07，t1=7.92；OPN mRNA 2.80±0.25 vs. 0.30±0.08,t2=9.87，均P<0.05)。siRNA干預組與未干預組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖1～3、表1。

A:未干預組；B:siRNA干預組；C:OPN siRNA干預組。

圖1OPN siRNA干擾前后OPN、NF-κBp65蛋白在腺上皮細胞中的表達

a:P<0.05，與OPN siRNA干預組比較。

圖2OPN siRNA干擾前后OPN蛋白、mRNA蛋白在腺上皮細胞中的表達

2.2OPN siRNA干擾前后NF-κBp65蛋白、mRNA的表達比較與siRNA干預組比較，OPN siRNA干擾后細胞中NF-κBp65蛋白及mRNA的表達明顯減弱，且差異具有統計學意義(NF-κBp65蛋白2.90±0.26 vs. 1.20±0.09，t1=-2.13,mRNA 3.50±0.28 vs. 1.30±0.10，t2=-8.61,均P<0.05)。siRNA干預組與未干預組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖1、3、4、表1。

圖3　OPN siRNA干擾前后OPN、NF-κBp65

2.3OPN siRNA干擾前后細胞侵襲性比較與siRNA干預組比較，OPN siRNA干擾后原代腺上皮細胞的侵襲性明顯降低，差異有統計學意義(65.0±3.78 vs.24.0±1.56,t=2.38,P<0.05),siRNA干預組與未干預組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖5、6、表1。

a:P<0.05，與OPN siRNA干預組比較。

圖4OPN siRNA干擾前后NF-κBp65蛋白、mRNA在腺上皮細胞中的表達

圖5　3組顯微鏡下圖像

a:P<0.05，與OPN siRNA干預組比較。

圖6OPN siRNA干擾前后原代腺上皮細胞的侵襲性比較

圖7　　OPN、NF-κBp65在腺上皮細胞中的表達關系

2.4OPN、NF-κBp65在細胞中的表達關系OPN、NF-κBp65在EMS患者在位內膜腺上皮細胞中的表達呈明顯的正相關(r=0.87)，見圖7。

表1　OPN siRNA干擾前后OPN、NF-κBp65蛋白、mRNA積極細胞侵襲性的變化

3討論

OPN是從骨組織中分離出來的一種磷酸化糖蛋白，組成結構中富含精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸序列。有研究表明，OPN與惡性腫瘤的發生、發展密切相關，它通過與其受體avβ3結合后激活依賴MAPK/PI3K通路的NF-κB通路，進而促進細胞中尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)和MMPs的分泌,介導細胞侵襲過程、MMPs的降解和重塑、細胞遷移、宿主免疫細胞的逃逸和新生血管的形成及發揮抑制細胞凋亡、促進腫瘤血管的生成及腫瘤細胞的轉移進而誘導腫瘤的發生[7-9]。NF-κB是Sen與Baltimore于1986年首次在成熟的淋巴細胞中發現的一種真核細胞轉錄因子,它是NF-κB/Rel蛋白家族成員之一,以最常見的p50/p65異源性二聚體形式存在于細胞核中參與許多基因轉錄的起始調節，如眾多的細胞因子、黏附分子、蛋白酶類及炎癥因子[10]。在人體的正常情況下，NF-κB存在于細胞質并與其抑制蛋白(IkB)結合,當受到外界異常刺激時,使IkB 磷酸化并被水解使NF-κB與抑制劑分離從細胞質進入細胞核參與細胞的轉錄調控[11]。近幾年，NF-κB在EMS中的研究頗受關注。本課題組的前期試驗已經在EMS患者及大鼠EMS模型的組織及細胞水平證實OPN、NF-κBp65在EMS的在位、異位內膜中高表達且呈正相關，且二者與細胞的侵襲性明顯相關，通過雌孕激素及其激活劑、抑制劑干預EMS患者在位內膜腺上皮細胞后發現，OPN、NF-κBp65的表達及細胞的侵襲性也相應增加及減弱[12]。國內孫群燕[13]建立小鼠EMS模型并給予基因NF-κBp50敲除后發現與雌激素介導的痛覺過敏和炎癥性疼痛密切相關的PKCepsilon因子的表達明顯減弱，與激素類藥物緩解EMS患者癥狀的機制相符,進一步驗證了NF-κB在EMS的發病過程中發揮重要作用，與本課題組前期試驗結果基本一致。

EMS在病理上雖為良性疾病但其有著與惡性腫瘤相似的特征，如異地黏附、侵襲、轉移及復發等，EMS的治療手段很有限，主要以手術治療為首選,但手術常難以清除所有藥物治療病灶[14-15]。國內有學者通過構建OPN-siRNA的慢病毒載體,發現可以明顯抑制結腸癌SW480細胞、胃癌細胞系GC9811的增殖，進而為惡性腫瘤的治療奠定了基礎[16-17]。故本試驗通過探索導致EMS的關鍵因子進而通過阻斷其表達來達到EMS的靶向治療。本研究在前期試驗結果OPN、NF-κB于EMS患者在位、異位內膜腺上皮細胞中高表達的基礎上，通過質粒構建OPN 特異性siRNA干擾EMS患者在位內膜腺上皮細胞后經Westen blot、RT-PCR及穿膜實驗等方法檢測發現OPN、NF-κBp65蛋白、mRNA的表達明顯下降，且腺上皮細胞的侵襲性也相應降低。因此，本研究結果提示，OPN可能是通過NF-κB通路促進uPA、MMPs的分泌，加速細胞外基質及基底膜降解，促進異位內膜的黏附、種植和生長，進而誘導EMS的發生。但是確切的分子機制還需要進一步的實驗證實。因此，筆者認為NF-κB極有可能是OPN誘導EMS發生的關鍵樞紐，也是EMS藥物靶向治療的關鍵點。

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Expression of NF-κBp65 in glandular epithelial cells of endometriosis after OPN intervention and its influence on cell invasiveness*

Bai Zhimiao1,Lu Yufeng1,Yang Mei1,Li Wangshu1,Ha Chunfang2△

(1.Ningxia Medical University,Yinchuan,Ningxia 750004,China;2.General Hospital of Ningxia Medical University/Key Labroatory of Fertility Preservation and Maintenance of Ningxia,Yinchuan 750004,China)

[Abstract]ObjectiveTo explore the influence of OPN in eutopic glandular epithelial cells of endometriosis on the NF-κBp65 expression and its relationship with the cell invasion.MethodsThe eutopic primary glandular epithelial cells in 12 cases of endometriosis were performed the primary isolation and culture.The cells were collected after 24 h OPN siRNA intervention.Western blot and RT-PCR methods were adopted to detect the expressions of OPN,NF-κBp65 protein and its mRNA before and after intervention.The Transwell experiment was used to detect the change of cell invasiveness before and after intervention.ResultsThe expression of OPN protein and mRNA after interfering primary glandular epithelial cells by OPN siRNA was significantly decreased,and the difference was statistically significant (t1=7.92,t2=9.87,P<0.05).the expression of NF-κB p65 protein and mRNA after OPN siRNA interfering primary glandular epithelial cells was obviously weakened,the difference was statistical significant(t=2.38,P<0.05).the invasiveness of primary glandular epithelial cells after OPN siRNA intervention was significantly decreased,the difference was statistically significant(t=2.38,P<0.05).The expression of OPN and NF-κBp65 had a significantly positive correlation in eutopic endometrial glandular epithelial cells (r=0.87).ConclusionThe expression of OPN and NF-κBp65 is significantly decreased after OPN siRNA interfering eutopic endometrial glandular epithelial cells,therefore OPN most likely lead to the occurrence and development of endometriosis via the NF-κB pathway.

[Key words]endometriosis;osteopontin;NF-κBp65

doi:論著·基礎研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.09.004

* 基金項目：國家自然科學基金資助項目(81160078)。

作者簡介：白治苗(1991-)，碩士，住院醫師，主要從事婦科腫瘤方面的研究。△通訊作者,E-mail：hachunfang@163.com。

[中圖分類號]R574

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)09-1163-04

(收稿日期：2015-10-08修回日期：2015-12-22)