不同濃度的普伐他汀對小鼠巨噬細胞極性的影響研究

谷祥任，張　雁

(湖南省張家界市人民醫院心血管內科　427000)

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不同濃度的普伐他汀對小鼠巨噬細胞極性的影響研究

谷祥任，張雁△

(湖南省張家界市人民醫院心血管內科427000)

[摘要]目的探討不同濃度的普伐他汀對小鼠巨噬細胞極性的影響。方法對小鼠骨髓來源的巨噬細胞進行體外培養，以0 μmol/L普伐他汀鈉組作為對照組，分別給予10、25、50 μmol/L的普伐他汀鈉進行藥物干預24 h，用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測白細胞介素(IL)-10、IL-12的分泌，流式細胞儀檢測細胞膜CD16/32、CD206的表達，熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)檢測Toll樣受體4(TLR4)、髓樣分化因子88(MyD88)、干擾素調控因子5(IRF5) mRNA的表達。結果普伐他汀鈉干預后的巨噬細胞，隨著普伐他汀鈉的濃度升高，IL-12、CD16/32的表達下降，而IL-10、CD206的表達升高，并伴有TLR4、MyD88、IRF5 mRNA的表達下調，且呈劑量依賴性。結論普伐他汀鈉促進巨噬細胞向抗炎性M2型極化，該效應可能與普伐他汀鈉的抗炎作用有關。

[關鍵詞]普伐他?。谎装Y；巨噬細胞極性；動脈粥樣硬化

炎癥與動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)密切相關。AS更被認為是一種慢性炎癥性疾病[1]。巨噬細胞作為AS發生發展的關鍵細胞，其可見于AS的各個階段。有研究發現，巨噬細胞是一種兼具促炎與抗炎作用于一體的異質性細胞，在不同的環境與條件下表現為不同的表型[2]：M1型(經典激活型)與M2型(替代激活型)，前者表現為促炎性，能釋放炎癥介質，參與炎性反應，與人群中冠心病的患病率和病死率可能呈正相關；后者表現為抗炎性，分泌許多抗炎因子，如轉化生長因子-β(TGF-β)、血管內皮生長因子(VEGF)參與組織修復，與動脈粥樣硬化性心血管疾病的發病率可能呈負相關,有抗AS的作用。已有研究表明，二者能相互轉化，可成為防治AS的新策略[3]。研究發現，作為心血管疾病的常用藥物，他汀類除具有傳統的降脂效應外，還具有抗炎的作用，具有逆轉斑塊的效應，但具體機制尚不清楚。本研究以不同濃度的水溶性最高的他汀類代表藥普伐他汀鈉作用于體外培養的巨噬細胞，觀察他汀類藥物濃度因素對巨噬細胞極性的影響，探討其抗炎、抗AS的細胞和分子機制。

1材料與方法

1.1材料(1)實驗動物：SPF級4～6周齡C57BL/6雌性小鼠，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。(2)儀器與試劑：重組小鼠γ-干擾素(IFN-γ，Peprotech公司)，普伐他汀鈉原料藥(浙江海正藥業有限公司)，脂多糖(LPS,Sigma公司)，異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)標記的大鼠抗小鼠F4/80抗體(Biolegend公司)，FITC標記的大鼠抗小鼠CD16/32抗體(Biolegend公司)，FITC標記的大鼠抗小鼠 CD206 抗體( AbD Serotec 公司)及對應的同型抗體，小鼠白細胞介素(IL)-10，IL-12酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒(達科為生物技術有限公司)，RNApure高純總RNA快速提取試劑盒(艾德萊生物科技有限公司)，M-MLV逆轉錄試劑盒(Invitrogen公司)，熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒 Maxima SYBR Green qPCR Master Mix(Thermo Scientific公司)。FACSAria Ⅲ流式細胞儀(美國BD公司)，多功能酶標儀(瑞士Tecan公司)，7500 Fast實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

1.2方法

1.2.1M0型巨噬細胞模型的建立借鑒Pradel等[4]的方法，將C57BL/6小鼠頸椎脫臼處死，無菌分離出股骨和脛骨，截斷骨骺端，用2.5 mL注射器吸取培養基(20%胎牛血清、100 μg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素的DMEM培養液)沖洗骨髓，收集沖洗物， 2 000 r/min離心10 min后棄上清液，加入含L929成纖維細胞上清液的培養基(20%胎牛血清、100 μg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素的DMEM培養液)，培養7 d后棄去未貼壁細胞，再在不含L929成纖維細胞上清液的培養基中進行培養，1 d后獲得的貼壁細胞即為骨髓來源的巨噬細胞(M0型巨噬細胞組)。

1.2.2M1型巨噬細胞模型的建立去除懸浮的細胞及舊的細胞培養液，重新換上不含L929成纖維細胞上清液的培養基與貼壁的細胞共培養，在Vats等[5]的方法基礎上濃度減半(預實驗顯示減半后的濃度效果較佳，細胞無成片死亡或狀態極差的情況)，即脂多糖(LPS)2.5 ng/mL和IFN-γ 50 U/mL，對骨髓來源的M0型巨噬細胞進行12 h的刺激，使其形成M1型巨噬細胞。

1.2.3實驗分組實驗分為4組。對照組：即M1型巨噬細胞組(0 μmol/L普伐他汀鈉組)；用藥組：分別給予10、25、50 μmol/L的普伐他汀鈉對M1型巨噬細胞進行藥物干預24 h。

1.2.4ELISA測定細胞因子分泌收集各組巨噬細胞培養上清液，按照試劑盒說明操作，檢測IL-10、IL-12的分泌。加入配好的標準品，設置對照，在450 nm波長處檢測吸光度(OD值)。

1.2.5流式細胞術檢測細胞膜表面抗原表達0.25%胰蛋白酶消化貼壁細胞，PBS洗滌1次，離心，去除上清液后用100 μL PBS重懸細胞，再分別加入0.25 μg FITC標記的大鼠抗小鼠F4/80抗體、0.5 μg FITC標記的大鼠抗小鼠CD16/32抗體、0.5 μg FITC標記的大鼠抗小鼠CD206抗體及對應的同型抗體，4 ℃避光孵育30 min，2 000 r/min離心，PBS沖洗2次，300 μL PBS重懸后再用流式細胞儀進行檢測。

1.2.6RNA提取及熒光定量PCR檢測收集各組細胞，提取細胞總RNA，操作嚴格按照說明書進行。逆轉錄生成cDNA，然后-20 ℃保存。采用美國ABI 7500 Fast實時熒光定量PCR儀進行檢測。引物由Invitrogen公司設計合成，TLR4 上游：5′-AGA CCT CAG CTT CAA TGG TG-3′；下游：5′-GAG ACT GGT CAA GCC AAG AA-3′。MyD88上游：5′-TCC GGC AAC TAG AAC AGA CAG ACT-3′；下游：5′-GCG GCG ACA CCT TTT CTC AAT-3′。IRF5上游：5′-AAT ACC CCA CCA CCT TTT GA-3′；下游：5′-TTG AGA TCC GGG TTT GAG AT-3′。為保證各cDNA樣本量的均一性，采用β-actin作為內參。β-actin上游：5′-TCC GTA AAG ACC TCT ATG CC-3′,下游：5′-TAC TCC TGC TTG CTG ATC C-3′。采用兩步法擴增目的DNA片段，每個樣本設置3個復孔，反復檢測3次，采用2-△△Ct法分析基因表達。定量PCR反應體系配置見表1。

表1　定量PCR反應體系的配置

1.3統計學處理采用SPSS19.0軟件對數據進行統計分析；多組間均數差異比較先采用方差分析，再用S-N-K檢驗進行兩均數間的兩兩比較；以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1M0型巨噬細胞模型的鑒定M0型巨噬細胞的鑒定主要有表型(F4/80)、形態及吞噬功能測定(如吞噬墨汁、雞紅細胞、中性紅細胞等)3種鑒定方法，其中，表型鑒定是最具可靠性的鑒定手段。本實驗采集的骨髓細胞，經L929成纖維細胞分泌的巨噬細胞集落刺激因子(macrophage-colony stimulating factor,M-CSF)的作用，在含L929成纖維細胞上清液的培養基中培養7 d后，流式細胞術檢測小鼠巨噬細胞特異性標記F4/80示巨噬細胞的純度高達96%(圖1)，可用于后續試驗。

圖1　M0型巨噬細胞F4/80的表達(96%)

2.2M1型巨噬細胞模型的鑒定將IFN-γ(50 U/mL)和LPS(2.5 ng/mL)聯合刺激M0型巨噬細胞后，通過檢測發現，CD16/32陽性表達率為(78.15± 2.02)%，CD206陽性表達率為(6.74± 3.08)%(表2)。IL-12的分泌較高，IL-10的分泌較低(圖2)。與M1型巨噬細胞的表型特點相符。

M0：M0型巨噬細胞組；M1:M1型巨噬細胞組；10P：10 μmol/L普伐他汀鈉組；25P：25 μmol/L普伐他汀鈉組；50P：50 μmol/L普伐他汀鈉組。

圖2各組巨噬細胞IL-10、IL-12的分泌水平

2.3各組形成的巨噬細胞表型指標檢測巨噬細胞分泌的IL-12、IL-10及膜表面抗原蛋白分子CD16/32、CD206是鑒定巨噬細胞表型的主要指標。通過檢測發現，普伐他汀鈉組炎癥因子IL-12的分泌和CD16/32的陽性表達率均低于M1型巨噬細胞組,差異有統計學意義(P<0.05),而抗炎因子IL-10的分泌和CD206的陽性表達率較M1型巨噬細胞組升高明顯，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

2.4熒光定量PCR檢測各組TLR4、MyD88、IRF5 mRNA的基因表達M1型巨噬細胞組TLR4、MyD88、IRF5 mRNA的表達最高，而經不同濃度的普伐他汀鈉干預后，其TLR4、MyD88、IRF5 mRNA的表達下降明顯，呈劑量依賴性，與M1型巨噬細胞組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表2　各組巨噬細胞表型指標檢測±s,n=4)

a:P<0.05，與M1型巨噬細胞組比較；b:P<0.05，與10 μmol/L普伐他汀鈉組比較；c:P<0.05，與25 μmol/L普伐他汀鈉組比較。

表3　各組TLR4、MyD88、IRF5 DNA的相對拷貝數檢測

a：P<0.05，與M1型巨噬細胞組比較;b:P<0.05，與10 μmol/L普伐他汀鈉組比較；c:P<0.05，與25 μmol/L普伐他汀鈉組比較。

3討論

炎癥是驅動AS及其相關疾病發生發展的主要原因[6]。目前，對炎癥與AS的研究涉及多個方面，在細胞層面主要有T淋巴細胞、內皮細胞、血管平滑肌細胞以及巨噬細胞等。研究表明，巨噬細胞在AS過程中發揮核心作用，因為它是脂類代謝和炎癥免疫反應的調節劑[7]。巨噬細胞是一種具有雙向調節作用的免疫細胞，具有促炎與抗炎兩種作用，而巨噬細胞極性就是這兩種極端性質。M1型巨噬細胞分泌炎性因子IL-12,高表達膜抗原CD16/32,與炎性損傷有關；而M2型巨噬細胞分泌抗炎因子IL-10，高表達膜抗原CD206，有抑制炎癥的作用。研究發現，在特定條件下，AS斑塊中的M1與M2型巨噬細胞可相互轉化，根據數量優劣表現為促炎或抗炎的作用[8]。

作為調脂的常規用藥，他汀類藥物還具有其他的多效性作用，如穩定粥樣斑塊，改善血管內皮功能，保護神經，抗凝防血栓和抗炎等作用，尤其需要特別關注的是抗炎作用。研究顯示其與斑塊的穩定、血管壁的內皮功能亦密切相關，在急性冠脈綜合征(ACS)早期患者中使用能夠抑制血管內皮的炎性反應，穩定粥樣斑塊，改善血管內皮功能[9-10]。

人類和小鼠AS病變顯示出增強的 TLR4 表達。觀察發現，經oxLDL刺激后，在AS區域TLR4 表達增加[11]。除了TLR3外，MyD88能傳遞所有TLR受體的信號，是一種非常關鍵的銜接蛋白。Bjorkbacka等[12]研究顯示MyD88 的缺失及滅活，能導致巨噬細胞招募到動脈壁的減少，并引起AS的減少，與趨化因子相關聯。新的研究表明，IRF5可作為控件操縱巨噬細胞抗炎或促炎的特性[13]。Weiss等[14]為了弄清IRF5的表達在巨噬細胞中的作用是否與炎癥性巨噬細胞存在相關聯，采用活體小鼠實驗性誘導成關節炎的做法來檢測IRF5的表達，發現關節腔中的巨噬細胞IRF5的表達升高，其他相關檢測符合M1型巨噬細胞或炎癥性巨噬細胞的特征，提示IRF5與炎癥相關，其表達升高可作為炎癥性巨噬細胞或M1型巨噬細胞的一個標志。

現有的研究資料顯示，炎性反應與巨噬細胞上TLR4及其中下游的MyD88、IRF5傳導通路密切相關[15]。本實驗從TLR4-MyD88-IRF5分子信號通路出發，用他汀類代表藥普伐他汀鈉，以10、25、50 μmol/L的濃度進行藥物干預發現，與M1型巨噬細胞組比較，不同濃度的普伐他汀鈉干預組炎癥標志物IL-12、CD16/32的表達均下降，而抗炎標志物IL-10、CD206的表達均升高，并伴有TLR4、MyD88、IRF5 mRNA的表達下調，且呈劑量依賴性，推測他汀類藥物可能通過抑制TLR4-MyD88-IRF5分子信號通路來調控巨噬細胞的極性，使M1型巨噬細胞極化為M2型巨噬細胞，進而發揮抗炎效應，其具體機制尚需更進一步研究。

綜上所述，在AS的發生發展過程中，機體始終存在著巨噬細胞促炎與抗炎的極性轉換，而他汀類代表藥普伐他汀鈉具有促進M1型向M2型轉換而發揮抗炎的作用，這為他汀類藥物對AS的防治提供了理論支持。

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Effect of different concentrations of pravastatin treatment on macrophage polarity in micer

Gu Xiangren,Zhang Yan△

(Department of Cardiology,Zhangjiajie Municipal People′s Hospital,Zhangjiajie,Hunan 427000,China)

[Abstract]ObjectiveTo study the effect of different concentrations of pravastatin treatment on macrophage polarity in mice.MethodsThe mice bone marrow sources of macrophages were cultured in vitro,with the 0 μmol/L sodium pravastatin group as control,by giving 10,25,50 μmol/L sodium pravastatin to conduct the drug intervention for 24 h.The enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect the secretion of interleukin 10 (IL-10) and IL-12;the flow cytometry instrument was used to detect cell membrane CD16/32,CD206 expression;real time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) was adopted to detect toll-like receptor 4 (TLR4),myeloid differentiation factor 88 (MyD88),interferon regulatory factor 5 (IRF5) mRNA expression.ResultsAfter the intervention of pravastatin sodium on macrophages,as the pravastatin sodium concentration increase,the expression of IL-12 and CD16/32 was decline,while the expression of IL-10 and CD206 was risen,which was accompanied by TLR4,MyD88,IRF5 mRNA expression down regulatyion,and a dose dependent manner.ConclusionSodium pravastatin promote the polarization of macrophages toward an anti-inflammatory macrophage phenotype (M2),this effect may be related with the anti-inflammatory effect of sodium pravastatin.

[Key words]pravastatin;inflammation;macrophage polarity;atherosclerosis

doi:論著·基礎研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.09.007

作者簡介：谷祥任(1975-)，碩士，副主任醫師，主要從事心血管疾病的研究及臨床、介入工作。△通訊作者，E-mail:yz0369@163.com。

[中圖分類號]R363

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)09-1173-03

(收稿日期：2015-09-18修回日期：2015-12-10)