人參皂苷Rg1對非酒精性脂肪肝病大鼠脂肪酸β-氧化的改善作用研究

2016-06-15 01:45:24廖文云

重慶醫學 2016年9期

廖文云,徐　丹

廖文云1,徐丹2△

[摘要]目的研究人參皂苷Rg1對非酒精性脂肪肝病(NAFLD)大鼠β-氧化的作用。方法將120只SD大鼠分為對照組(CON組)、模型組(HFD組)及人參皂苷Rg1低、中、高劑量組(GLD、GMD、GHD組)和熊去氧膽酸鈉治療組(PDT組)，每組20只，分別于治療4、8周后處死大鼠各半，肝臟切片HE染色，檢測肝功能、血脂、肝臟脂酰CoA合成酶1(CoASH1)、脂酰肉毒堿轉移酶I(CATI)及酰基輔酶A氧化酶1(ACOX1) mRNA和蛋白表達。結果治療4周后，肝臟HE染色GHD組有改善，PDT、GLD、GHD組未見改善；8周后，PDT組與GLD組仍有少量脂肪顆粒聚集，GMD組和GHD組看不到任何脂滴浸潤；治療4周后，PDT、GLD、GMD、GHD組與HFD組相比，天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、堿性磷酸酶(AKP)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)明顯降低(P<0.05)，8周后進一步降低；治療4周后，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)4個組均升高，8周后幾乎恢復到對照組的水平；治療4周后肝臟組織CoASH1、CACTI及ACOX1表達4個組均顯著升高(P<0.05)，治療8周后改善更為明顯。結論人參皂苷Rg1可通過調節大鼠β-氧化來改善脂代謝及肝功能。

[關鍵詞]人參皂苷Rg1；非酒精性脂肪肝病；脂酰CoA合成酶；脂酰肉毒堿轉移酶I；酰基輔酶A氧化酶1

非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是臨床中較為常見的一種代謝性肝病，隨著人們飲食習慣的改變，該病有增加的趨勢。最新的研究顯示我國NAFLD發病率已高達25%，已經成為僅次于病毒性肝炎的第2大疾病[1-2]。人參皂苷Rg1是從人參以及三七中提取的一種皂苷單體化合物，近年來關于其在藥學領域中的價值受到了眾多學者的關注[3]，Tushuizen等[4]研究顯示人參皂苷Rg1有促進大鼠海馬神經發育的作用，Zhou等[5]研究顯示人參皂苷Rg1對腫瘤有很好的抑制作用，同時其對糖尿病糖代謝也有一定的促進作用。目前關于人參皂苷Rg1對NAFLD的作用也有文獻報道[6]，但具體機制尚不清楚，本文擬觀察人參皂苷Rg1對NAFLD大鼠β-氧化的作用，現報道如下。

1材料與方法

1.1實驗動物雄性SD大鼠120只，體質量160～180 g，大鼠[合格證號：SYXK(滇)2011-0004]、基礎飼料均由昆明醫科大學動物實驗部提供。

1.2試劑豬油市場自購；膽固醇及膽酸鈉購自上海金穗生物公司；人參皂苷Rg1由昆明醫科大學藥學院提供；三酰甘油(triglycerides，TG)、膽固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白膽固醇(ligh-density lipoprotein-C，LDL-C)及高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein-C，HDL-C)試劑盒由南京建成生物提供；丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)及堿性磷酸酶(AKP)等試劑盒購自上海達為科生物科技有限公司；引物為上海英駿生物有限公司生產；總RNA提取試劑盒購自天根生物有限公司；瓊脂糖購自美國Invitrogen生物公司；抗體肉堿酰基轉移酶Ⅰ(carnitine acyltransferase I，CATI)，脂酰CoA合成酶1(Acyl-CoA synthetase1，CoASH1)及乙酰輔酶A氧化酶1(Acyl-CoA oxidase1，ACOX1)購自美國Santa Cruz公司，二抗購于中杉金橋公司。

1.3方法

1.3.1大鼠飼料構成和造模方法大鼠高脂飼料的配方完全參考國際上目前流行的配方[7]，所配制飼料由昆明醫科大學動物試驗部加工完成，具體成分為：豬油20%、TC 2%、膽酸鈉0.5%及常規飼料營養成分構成。在造模期間所有造模組大鼠均給予充足的飼料和高濃度紅糖水飲用，造模時間為8周，8周后每組各取二組大鼠檢測其肝功能以及行肝臟HE染色檢驗是否造模成功。

1.3.2NAFLD模型的建立及給藥方法為防止造模過程中大鼠死亡，本次共飼養150只大鼠，期間20只大鼠給予普通飼料作為空白對照組(CON組)，剩余130只大鼠給予造模，期間有16只死亡，將造模成功的114只大鼠根據給藥劑量的不同隨機分組，共分為5組，其中高脂飲食組(不給予后期治療，HFD組，n=20)、人參皂苷Rg1低、中、高劑量干預組(GLD、GMD、GHD組，n=24)及熊去氧膽酸鈉治療組(PDT組，n=22)，造模成功后CON組及HFD組均不予任何干涉，GLD、GMD、GHD組分別給予人參皂苷Rg1 5、10、20 mg·kg-1·d-1治療。

1.3.3標本采集在大鼠處死前嚴格控制衛生，所有手術人員均消毒且佩戴手套及口罩；之后開始采集標本，采集時首先稱取大鼠體質量、然后給予水合氯醛麻醉；麻醉后將大鼠固定于解剖板上暴露腹腔，手術刀沿腹中線迅速切開腹部取出肝臟，之后使用注射器從心臟取血，將血液離心后和肝臟置于-80 ℃冰箱保存。

1.3.4病理學檢查及相關指標檢測方法病理學檢查采用HE染色，取樣時統一取肝左葉置于4%的中性甲醛中浸泡，之后交由云南省第一人民醫院病理科完成。TC、TG、HDL-C以及LDL-C等指標的測定嚴格按照試劑盒說明書完成。

1.3.5RT-PCR檢測mRNA的表達用微量天平精確稱取30 mg肝臟組織，立即用相應試劑盒提取總RNA并定量，將定量后的RNA采用超純水調平，之后根據逆轉錄試劑盒提示每組取2 μg逆轉錄cDNA，逆轉錄完成后將cDNA進行產物擴增，擴增條件為94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環；最后給予72 ℃總延伸5 min。擴增完成后進行瓊脂電泳，拍照收集條帶圖像，Image J計算熒光強度值，每組實驗重復3次。CoASH1引物設計為，Primer A：5′-CTT CGG TCG TGA TGA AAG GA-3′，Primer B：5′-ATA GCT GAC GGT TGC CGT AC-3′，產物長度為158 bp。CATI引物設計為，Primer A：5′-CTT GCA TGG CTG TGA GAA GA-3′，Primer B ：5′-AGT CGG ACT GCC TTC AGT GA-3′，產物長度為188 bp。ACOX1引物設計為，Primer A：5′-GTT ACG TGG CGC ATT GAA GA-3′，Primer B ：5′-TAG TTC CTC GCG GGA ACG AT-3′，產物長度為169 bp。β-actin引物設計為，Primer A：5′-GTG ACG AGG CCC AGA GCA AGA G-3′，Primer B：5′-ACG CAG CTC ATT GTA GAA GGT GTG G-3′，產物長度為123 bp。

1.3.6Western blot檢測蛋白表達用微量天平精確稱取肝臟100 mg，立即用組織裂解液制作勻漿，勻漿制作好后4 000 r/min離心收集上清液，上清液提取后采用BCA蛋白定量試劑盒對蛋白進行定量，定量后將蛋白調平，之后每組各取60 μg 進行SDS聚丙烯酰胺凝電泳，電泳完成后半干轉移到PVDF模，然后按照常規方法添加一抗二抗反應，ECL發光試劑曝光洗片，圖像掃描后用Image J計算各條帶熒光值，每組實驗重復3次。

1.4統計學處理采用SPSS19.0統計學軟件進行統計分析，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1各組大鼠肝臟HE染色比較肝臟切片HE染色可以看出，CON組細胞表面光滑、大小均一，沒有任何脂肪空泡，而HFD組細胞有一定的腫脹，且細胞核受到了一定的擠壓，提示有脂肪空泡的存在，治療4周后，脂肪空泡數量均明顯減少，治療8周后脂肪空泡進一步減少，但仍有一定的炎性反應，見圖1。

2.2各組大鼠肝功能比較治療4周后，PDT、GLD、GMD、GHD組與HFD組比較，AST、ALT及AKP水平明顯降低(P<0.05)，同時可看出PDT組改善沒有GLD、GMD、GHD組明顯；治療8周后，PDT、GLD、GMD、GHD組與HFD組比較，ALT、AST和AKP 進一步降低，和CON組基本一致，同時可發現PDT改善效果與GLD及GMD相近，但仍然沒有GHD組降低得多，見表1。

2.3各組大鼠血脂水平比較治療4周后，4個治療組TC均明顯低于HFD組(P<0.05)，同時PDT組低于GLD組，與GMD組及GHD組基本相近；TG水平PDT、GMD、GHD組要明顯低于HFD組(P<0.05)，PDT 組與GMD組改善大體一致，好于GLD組，但沒有GHD組改善明顯；HDL-C水平GMD組及GHD組要明顯高于HFD組(P<0.05)，PDT組低于GLD、GMD、 GHD組；PDT組與GLD、GMD、GHD組LDL-C水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)，但均低于HFD組(P<0.05)。治療8周后，TC、TG及HDL-C 3個指標PDT組沒有 GLD、GMD、GHD組改善明顯；LDL-C與4周時情況基本一致，見表2。