比索洛爾對心衰大鼠心室肌細胞內向整流鉀電流的影響

王建麗， 馬愛群， 王　賀， 王亭忠， 韓　克

(1成都市第六人民醫院心血管內科，成都　610051； 2西安交通大學醫學院第一附屬醫院心血管內科，教育部環境與疾病相關基因重點實驗室，西安　710061； *通訊作者，E-mail：maaiqun@medmail.com.cn)

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比索洛爾對心衰大鼠心室肌細胞內向整流鉀電流的影響

王建麗1,2， 馬愛群2*， 王賀2， 王亭忠2， 韓克2

(1成都市第六人民醫院心血管內科，成都610051；2西安交通大學醫學院第一附屬醫院心血管內科，教育部環境與疾病相關基因重點實驗室，西安710061；*通訊作者，E-mail：maaiqun@medmail.com.cn)

摘要：目的觀察比索洛爾對容量超負荷心衰大鼠左室心肌細胞內向整流鉀電流(IK1)的影響。方法成年雄性SD大鼠(180-200 g)隨機分為假手術組、心衰組和比索洛爾干預組，采用腹主動脈-下腔靜脈穿刺造瘺法制作容量超負荷心衰模型。術后8周，比索洛爾干預組給予比索洛爾(1 mg/kg，1次/d)灌胃，干預4周后，檢測血清腦鈉肽(BNP)及超聲心動圖以評價心功能。急性酶解法分離大鼠左室心肌細胞，采用全細胞膜片鉗技術記錄動作電位及IK1電流，并繪制I-V曲線。結果心衰組與假手術組大鼠比較，心功能明顯下降，血清BNP水平(pmol/L)明顯升高(1 562.89±153.26 vs 225.57±63.62，P<0.01)，動作電位時程(APD,ms)延長(APD90：324.85±21.66 vs 137.80±15.24，P<0.01)，IK1電流密度減小(-140 mV：-23.20±2.10 vs-35.55±2.78，P<0.01)。比索洛爾干預可明顯改善心功能，縮短APD，增加IK1電流密度(-140 mV：-27.16±2.62 vs-23.20±2.10，P<0.01)。結論比索洛爾干預可改善慢性心衰大鼠的心功能，增加IK1電流密度。

關鍵詞：比索洛爾；心力衰竭；內向整流鉀電流；大鼠

慢性心力衰竭是大多數心血管疾病的終末階段，其中35%-50%發生惡性心律失常乃至猝死[1]。慢性心力衰竭發生過程中存在心肌結構重構與心電重構，相關離子通道的異常是心電重構的分子基礎，與惡性心律失常的發生密切相關[2]，其中最主要的電生理變化是心肌細胞動作電位時程(action potential duration，APD)延長，外向鉀電流減少或內向鈉電流增加[3]均可導致APD延長，主要外向鉀電流包括內向整流鉀電流(inward rectifier potassium current，IK1)、瞬時外向鉀電流(transient outward potassium current，Ito)和延遲整流鉀電流(delayed rectifier potassium curret，IK，包括快速激活成分IKr和緩慢激活成分IKs)[4]。

IK1是心肌最主要的背景外向鉀電流，主要參與靜息電位的維持和心肌動作電位3期終末的復極[5]。近年來有關慢性心衰時電壓依賴性鉀電流變化的多項研究中，較為一致的觀點是慢性心衰時心室肌細胞的Ito和IKs減小，大多數研究認為IKr無顯著變化，IK1在不同研究中結果差異較大[6,7]，這些研究結果的差異可能與動物種屬、心衰模型、心衰階段的不同有關。

β-受體阻滯劑是一種非傳統離子通道阻斷劑，歐洲心臟病學會(ESC)慢性心衰診療指南中推薦美托洛爾、比索洛爾、卡維地洛用于慢性心力衰竭的治療，其中比索洛爾是高選擇性β1-受體阻滯劑[8]。CIBIS Ⅰ-Ⅲ(心功能不全比索洛爾研究)是使用比索洛爾治療慢性心衰的大型多中心隨機試驗，CIBISⅡ表明比索洛爾能顯著降低心衰患者的再住院率、病死率及心源性猝死率[9]，這可能與比索洛爾減少惡性心律失常的發生有關，但具體電生理機制不完全清楚。本研究通過建立容量超負荷大鼠心衰模型，觀察其左室心肌細胞內向整流鉀電流的變化，以及比索洛爾的干預作用，為比索洛爾在慢性心衰治療方面提供電生理依據。

1材料與方法

1.1實驗動物與主要儀器

清潔級健康雄性Sprague-Dawely大鼠(封閉群)，體重180-200 g，約8周大(西安交通大學醫學院實驗動物中心提供，生產許可證：SCXK陜2012-003)。THONOS 2500心臟彩色超聲診斷儀(美國惠普公司)，BL-420E生物機能實驗系統(成都泰盟生物技術有限公司)，Axon 700B膜片鉗放大器、Digidata 1322A數/模轉換系統、pClamp10.0數據采集分析軟件(美國Axon公司)。

1.2主要試劑與溶液

腦鈉肽(brain natriuretic peptide,BNP)ELISA試劑盒(美國Assay Pro公司)，富馬酸比索洛爾片(德國默克公司)，Ⅱ型膠原酶(美國Worthington公司)，牛血清白蛋白(BSA)(美國Sigma公司)，其余試劑為國產分析純級。

含鈣臺氏液：NaCl 140 mmol/L、KCl 5.4 mmol/L、MgCl21.8 mmol/L、CaCl21.8 mmol/L、葡萄糖10 mmol/L、HEPES 10 mmol/L，NaOH調節pH為7.35-7.40；心肌消化酶液：30 ml無鈣臺氏液(不包含CaCl2，其余成分與含鈣臺式液相同)中加入10 mgⅡ型膠原酶、20 mg BSA；心肌細胞儲存液(KB液)：KCl 25 mmol/L、KH2PO410 mmol/L、MgCl23 mmol/L、Taurine 20 mmol/L、L-谷氨酸 70 mmol/L、EGTA 0.5 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、葡萄糖 10 mmol/L，KOH調節pH為7.35-7.40；記錄動作電位電極內液：NaCl 10 mmol/L、KCl 143 mmol/L、MgATP 2 mmol/L、EGTA 10 mmol/L、HEPES 10 mmol/L，KOH調節pH為7.30；記錄動作電位電極外液為含鈣臺氏液；記錄IK1電極內液：KCl 140 mmol/L、MgCl20.5 mmol/L、EGTA 10 mmol/L、HEPES 5 mmol/L、K2ATP 4 mmol/L，KOH調節pH為7.20；記錄IK1電極外液：無鈣臺式液中加入CaCl21.0 mmol/L、CdCl20.1 mmol/L、4-AP 5.0 mmol/L。

1.3心衰模型建立及心功能評價

大鼠隨機分為假手術組(sham operation，SO，n=16)、心衰組(heart failure，HF，n=20)和比索洛爾干預組(bisoprolol，BISO，n=20)。采用腹主動脈-下腔靜脈穿刺造瘺法[10]制作容量超負荷心衰模型，假手術組不進行造瘺，其余手術步驟與心衰組相同。術后8周經心臟彩超證實心衰模型建立成功后，比索洛爾干預組給予富馬酸比索洛爾灌胃(1 mg/kg，2 ml/只，1次/d)，假手術組和心衰組均以等容量去離子水灌胃，干預4周(28 d)后，心臟彩超[11]及BNP檢測以評價心功能。

1.4全細胞膜片鉗記錄動作電位及IK1

戊巴比妥鈉(40-50 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，開胸取出心臟，迅速將升主動脈安裝在心臟灌流裝置上，以Langendorff法主動脈逆行灌流，先灌流無鈣臺式液，待心臟內殘留血液沖洗干凈，心臟顏色變淡后，用心肌消化酶液循環灌流心臟(流速5 ml/min)約15-20 min。待左右心室充分消化，心肌蓬松變軟后，用無鈣臺氏液繼續沖灌(流速5 ml/min)12 min洗去酶液，終止反應。剪下心臟，置于氧飽和的KB液中，用眼科剪分出左右心室，剪碎左心室肌并稍加振蕩，使心肌細胞進一步分散成單個細胞，用220 μm尼龍網過濾，室溫(22-24 ℃)保存備用。

在電流鉗“I=Normal或Fast”的模式下給予脈寬5 ms、電流900 pA刺激，在1 Hz的頻率下記錄動作電位。使用方波階躍電壓刺激方法，Vh=-40 mV，給予-140～40 mV，階躍10 mV，TC為400 ms的去極化脈沖，記錄IK1，以各脈沖下電流密度幅值對相應膜電位作圖，得I-V曲線。

1.5統計學分析

2結果

2.1比索洛爾對心功能的影響

術后12周，與假手術組大鼠比較，心衰組反映左心室腔大小的LVEDs、LVEDd及反映左心室壁厚度的IVST、PWT均明顯增加(P<0.01)，EF值則明顯降低，BNP明顯升高(P<0.01，見表1)。表明左心室腔明顯擴張，心功能顯著下降，大鼠容量超負荷心衰模型建立成功。比索洛爾干預后反映左室腔大小及室壁厚度的指標均明顯下降，EF值升高，BNP水平顯著下降，表明比索洛爾干預能顯著改善慢性心衰時發生的心功能下降及心肌重構。

表1比索洛爾干預對心衰大鼠心功能指標的影響

Table 1The effect of bisoprolol on heart function in heart failure rats

組別n左室收縮末內徑LVEDs(mm)左室舒張末內徑LVEDd(mm)室間隔厚度IVST(mm)后壁厚度PWT(mm)左室射血分數LVEF(%)腦鈉肽BNP(pmol/L)假手術組102.98±0.395.88±0.381.47±0.141.45±0.2084.17±2.64225.57±63.62心衰組105.85±0.46**8.83±0.51**1.68±0.16**1.78±0.19**66.83±4.07**1562.89±153.26**比索洛爾干預組104.73±0.31**##7.27±0.58**##1.55±0.15*#1.62±0.14*#72.50±3.45**#789.31±97.28**##

與假手術組比較，*P<0.05，**P<0.01；與心衰組比較，#P<0.05，##P<0.01

2.2比索洛爾對動作電位的影響

與假手術組比較，心衰組大鼠的心率增快，QT及QTc間期均顯著延長(P<0.01)，提示慢性心衰時心率加快，動作電位時程延長。比索洛爾干預可減慢心率，縮短QT及QTc間期(P<0.05，見表2)，表明比索洛爾干預可部分逆轉慢性心衰時發生的心電重構。

大鼠左室心肌細胞動作電位呈三角形，無明顯平臺期(見圖1)。心衰組的靜息電位絕對值較假手術組明顯減低(P<0.01)，而比索洛爾干預可部分逆轉這一改變。反映除極過程的APA在心衰組及假手術組間無明顯差異，心衰組中反映復極過程的APD10、APD50及APD90均較假手術組明顯延長，而比索洛爾干預可明顯縮短心衰大鼠心室肌細胞的動作電位時程(見表3)。

2.3比索洛爾對IK1的影響

記錄各組大鼠左室心肌細胞IK1電流大小，計算其電流密度并繪制I-V曲線。按設定的刺激程序，記錄到一電壓依賴的內向電流(見圖2)，在400 ms內無明顯失活，IK1內向成分隨去極化而減小，反轉電位為-50 mV，在其以上轉為外向電流，具有明顯內向整流特性，其I-V曲線呈“N”形(見圖3)。

表2比索洛爾干預對心衰大鼠心電圖的影響

Table 2The effect of bisoprolol on ECG in heart failure rats

組別n心率(次/min)QT間期QT(ms)校正的QT間期QTc(ms)假手術組10413±21 60.33±2.88161.90±4.48心衰組10486±27**76.00±2.37**195.85±4.28**比索洛爾干預組10445±37*# 71.67±3.56**#184.63±7.41**##

與假手術組比較，*P<0.05，**P<0.01；與心衰組比較，#P<0.05，##P<0.01

刺激電位為-140～-90 mV時，心衰組較假手術組IK1電流密度絕對值顯著減小(P<0.05)，在-90 mV以上無明顯差異。而比索洛爾干預組在刺激電位為-140 mV～-130 mV時，IK1電流密度較心衰組顯著增加(P<0.05)。表明心衰時IK1電流密度顯著減小，而比索洛爾干預可部分逆轉這一改變。

A.假手術組　　　　　　　　　　B.心衰組　　　　　　　　　　　　　C.比索洛爾干預組圖1　三組大鼠左室心肌細胞動作電位記錄圖Figure 1　Action potential recordings of left ventricular cardiomyocyes in three groups

表3比索洛爾干預對心衰大鼠動作電位的影響

Table 3The effect of bisoprolol on action potential in heart failure rats

組別n靜息電位RP(mV)動作電位幅度APA(mV)動作電位復極10%時程APD10(ms)動作電位復極50%時程APD50(ms)動作電位復極90%時程APD90(ms)假手術組10-77.78±1.7994.22±1.6814.39±1.9890.58±12.47137.80±15.24心衰組10-56.25±2.31**92.43±5.3646.93±7.75**227.12±25.37**324.85±21.66**比索洛爾干預組10-69.13±2.34**##90.12±1.7129.55±3.34**##144.30±48.37*#235.48±20.33**##

與假手術組比較，*P<0.05，**P<0.01；與心衰組比較，#P<0.05，##P<0.01

圖2　三組大鼠左室心肌細胞IK1記錄圖Figure 2　IK1 current traces of left ventricular cardiomyocyes in three groups

與假手術組比較，*P<0.05，**P<0.01；與心衰組比較，#P<0.05，##P<0.01圖3　三組大鼠左室心肌細胞IK1的I-V曲線Figure 3　I-V curves of left ventricular cardiomyocyes in three groups

3討論

本研究通過建立容量超負荷大鼠心衰模型，觀察其左室心肌細胞內向整流鉀電流(IK1)的變化，以及比索洛爾的干預作用。結果表明，心衰大鼠IK1電流明顯減小，動作電位時程延長，比索洛爾干預可部分逆轉這些改變。

內向整流鉀電流主要參與維持心肌細胞的靜息膜電位和復極過程，影響動作電位的時段和形態，對維持心肌正常的興奮節律、防止心律失常的發生具有重要的意義[12]。慢性心力衰竭時，IK1電流減小，APD延長，心室復極延遲，促進早期后除極(EADs)的發生，導致觸發活動和快速型室性心律失常，包括尖端扭轉型室速[13]。IK1減小還會引起膜電位波動，造成膜電位的不穩定，并促進延遲后除極(DADs)的發生，從而增加發生室性心律失常的機率[14]。因此，調控IK1電流有助于減少室性心律失常的發生，減低心源性猝死率。

CIBISⅡ試驗表明比索洛爾可顯著降低心衰患者的病死率和心源性猝死率[9]，可能與其減少室性心律失常的發生有關，但具體機制不完全清楚。有多項研究表明β受體阻滯劑有逆轉心衰時離子通道重構的作用[15,16]，本課題組前期研究發現比索洛爾可逆轉容量超負荷心衰兔IKs、IK1、Ito的蛋白表達水平[17,18]及小電導鈣激活鉀通道的心電重構[19]。本研究表明，比索洛爾長期干預可增加心衰大鼠心室肌細胞的IK1電流密度，縮短動作電位時程，比索洛爾可改善慢性心衰時發生的心電重構，這說明比索洛爾改善心電重構的作用可能是其抗心律失常的重要因素。

那么，比索洛爾對IK1電流的作用是通過直接離子通道調控作用還是間接調控作用呢？慢性心衰時β腎上腺素受體過度激活，同樣參與心電重構過程，而假手術組無β腎上腺素受體過度激活，比索洛爾干預對其IK1電流無明顯影響。另外，最后一次比索洛爾灌胃在細胞分離前24 h，心肌細胞分離后灌流液里不含比索洛爾，因此無法觀察比索洛爾對離子通道的直接調控作用。這表明比索洛爾長期干預可逆轉慢性心衰心肌細胞IK1電流的變化，可能通過抑制β腎上腺素受體活性，影響離子通道的表達及功能，而非直接通道調控作用。結合本研究結果及課題組既往研究結果，認為比索洛爾可從整體上逆轉心電重構，進而減少心律失常等發生。這一作用可能是比索洛爾減少室性心律失常及心源性猝死率的機制之一，為其在心衰患者中的廣泛應用提供理論電生理依據。

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Effect of bisoprolol on inward rectifier potassium current in ventricular cardiomyocytes of heart failure rats

WANG Jianli1,2, MA Aiqun2*, WANG He2, WANG Tingzhong2, HAN Ke2

(1DepartmentofCardiovascularMedicine,SixthPeople’sHospitalofChengdu,Chengdu610051,China;2DepartmentofCardiovascularMedicine,FirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,KeyLaboratoryofEnvironmentandGenesRelatedtoDiseases;*Correspondingauthor,E-mail：maaiqun@medmail.com.cn)

Abstract：ObjectiveTo explore the effect of bisoprolol on inward rectifier potassium current(IK1) in left ventricular cardiomyocytes of volume-overload heart failure(HF) rats.MethodsAdult male SD rats(180-200 g) were randomly divided into sham operation group(SO), heart failure group(HF) and bisoprolol group(BISO). Volume-overload heart failure rats were established by abdominal arteriovenous fistula for 8 weeks, and then bisoprolol(1 mg/kg, quadrantly) was administrated for 4 weeks. Brain natriuretic peptide(BNP) and echocardiographic variables were determined to evaluate the heart function. Action potential(AP) and IK1were recorded by whole cell patch clamp technique.ResultsCompared with SO group, heart function and BNP level decreased in HF group[(1 562.89±153.26)pmol/L vs (225.57±63.62)pmol/L,P<0.01)]. The action potential duration(APD) was prolonged[(APD90:(324.85±21.66)ms vs (137.80±15.24)ms, P<0.01)], while the current density of IK1was decreased in HF group (-140 mV:-23.20±2.10 vs -35.55±2.78,P<0.01).Long term treatment with bisoprolol improved heart function, shortened the APD and increased the density of IK1(-140 mV: -27.16±2.62 vs -23.20±2.10, P<0.01).ConclusionBisoprolol could ameliorate the cardiac function and down-regulate IK1in HF rats.

Key words:bisoprolol;heart failure;inward rectifier potassium current;rats

基金項目：國家自然科學基金重點資助項目(30830051)

作者簡介：王建麗，女，1984-08生，碩士，住院醫師

收稿日期：2016-02-23

中圖分類號：R541.6

文獻標志碼：A

文章編號：1007-6611(2016)05-0401-05

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.05.001