糖尿病腎病尿毒癥患者成纖維細胞生長因子23和骨保護素與橈動脈血管鈣化的相關性

劉靜靜,任偉,王科,蘭雷,王冬梅

(安徽醫科大學附屬省立醫院、安徽省立醫院腎臟內科，合肥 230001)

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·論著·

糖尿病腎病尿毒癥患者成纖維細胞生長因子23和骨保護素與橈動脈血管鈣化的相關性

劉靜靜,任偉,王科,蘭雷,王冬梅

(安徽醫科大學附屬省立醫院、安徽省立醫院腎臟內科，合肥 230001)

[摘要]目的檢測糖尿病腎病尿毒癥患者血清及橈動脈成纖維細胞生長因子-23(FGF-23)和骨保護素(OPG)的表達，探討其與橈動脈血管鈣化(VC)的相關性。方法選取36例糖尿病腎病尿毒癥且尚未開始血液透析的患者為研究對象,并選取年齡、性別與之相匹配的健康人群40例作為對照組。在病例組建立自體動靜脈內瘺吻合手術時留取修剪下的橈動脈，行von kossa 染色檢測有無鈣化,并計算鈣化積分；免疫組織化學檢測橈動脈FGF-23和OPG的表達。測定兩組血清FGF-23、OPG、血紅蛋白濃度(Hb)、白蛋白(ALB)、鈣(Ca)、磷(P)、全段PTH (iPTH)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、C反應蛋白(CRP)的水平。結果病例組血清FGF-23、OPG水平明顯高于對照組(P<0.05)。隨著血管鈣化程度加重，FGF-23和OPG在血清的水平升高，并且在血管壁免疫組織化學染色陽性表達吸光度值升高，病例組血P、FGF-23、OPG與橈動脈血管鈣化有相關性。結論糖尿病腎病尿毒癥患者普遍存在橈動脈血管鈣化，FGF-23和OPG與橈動脈血管鈣化呈正相關。

[關鍵詞]糖尿病腎病；尿毒癥；成纖維細胞生長因子;骨保護素；血管鈣化

血管鈣化(VC)是在糖尿病、腎臟損害等疾病中常見的血管病變。尿毒癥患者血管鈣化為動脈中膜鈣化[1],有部分學者認為，腎動脈鈣化的程度是糖尿病患者進展為尿毒癥的獨立預測因素[2]。隨著分子生物學和免疫組織化學等科研技術的發展，尿毒癥患者血管鈣化，被證實為一多因素參與的類似骨和軟骨發育的主動調節過程，是主動的、可預防的，并且可以逆轉的高度可調控的復雜的生物學過程[3]。發生機制可能為，血液循環中抑制鈣化的因子如：骨保護素(OPG)、骨形態發生蛋白-7(BMP-7)、胎球蛋白A等的缺乏；以及隨著腎小球濾過率下降，促進鈣化的因子如：成纖維細胞生長因子-23(FGF-23)、骨形態發生蛋白-2 (BMP-2)、胰島素樣生長因素-1(IGF-1)等的增加，導致血管鈣化的發生發展。FGF-23和OPG，是新近研究發現的由骨細胞、成骨細胞及血管內皮細胞分泌的與動脈血管鈣化相關的蛋白因子，本文就其在糖尿病腎病尿毒癥患者血清和橈動脈血管壁的表達水平與橈動脈血管鈣化程度的相關性作一分析。

1對象與方法

1.1研究對象病例組：選取36例(男19例，女17例)于2014年1月至2015年1月在安徽省立醫院腎臟內科住院的尚未開始血液透析治療的糖尿病腎病尿毒癥患者，平均年齡(60.3±7.5)歲。收入標準為：①有較長時間的糖尿病病史，臨床上出現蛋白尿，低白蛋白血癥，腎功能異常，糖尿病眼底改變，根據美國腎臟病基金會慢性腎臟病的分期：GFR水平<15 mL/min，病程大于3個月；② 完善相關檢查已排除結締組織病、乙型肝炎、甲狀腺、腫瘤、遺傳性疾病(多囊腎、遺傳性腎炎)、梗阻性、藥物等繼發腎臟損害。主要排除標準：肝功能損害、嚴重感染性疾病、營養不良等。對照組：選取同一時間我院健康體檢中心的40例(男21例，女19例)體檢人群，平均年齡(63.3±10.4)歲，尿常規檢查無異常，肝腎功能正常，無高血壓、糖尿病等慢性病史。兩組研究對象年齡、性別匹配，具有可比性。本研究所有研究對象均簽署知情同意書，研究方案經本院醫學倫理委員會批準。

1.2血常規及生化檢查所有研究人群，空腹8 h以上，于次日清晨抽取靜脈血3 mL,在我院檢驗科生化實驗室協助下測定血紅蛋白(Hb)、白蛋白(ALB)、鈣(Ca)、磷(P)、全段PTH (iPTH)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、C反應蛋白(CRP)。血清FGF-23、OPG水平測定采用酶聯免疫復合物法(ELISA法)，嚴格按照試劑盒操作步驟進行檢測，試劑盒為上海源葉分裝美國R&D公司。

1.3病例組血管處理在病例組建立自體動靜脈內瘺吻合手術時，留取修剪后廢棄的橈動脈0.5～1 cm，經0.9%氯化鈉注射溶液充分沖洗后，置于4%甲醛中固定48 h，標本常規脫水、石蠟包埋、切片。von kossa染色：切片經二甲苯脫蠟后，于10% 硝酸銀避光浸染30 min，紫外線燈下照射30 min，經伊紅-蘇木素溶液中依次染色。結果判定：切片背景為紅色，棕黑色為鈣鹽沉積。血管免疫組織化學：切片脫蠟后置于盛有枸櫞酸鈉緩沖液的高壓鍋中，煮沸2 min。冷卻后，0.01%PBS緩沖液沖洗。滴加I抗，37 ℃保溫箱中孵育30 min，滴加檢測試劑PV-6000山羊抗兔IgG/HRP聚合物后，放置于37 ℃保溫箱中孵育20 min,應用二氨基聯苯胺(DAB)顯色。沖洗水沖洗、蘇木素復染、脫水、中性樹脂封片觀察。FGF-23、OPG I抗體購買于美國Bioworld Technology公司。II抗購買于北京中杉金橋生物技術有限公司。免疫組織化學結果：陽性反應細胞呈棕黃色，陰性對照無色。

1.4血管鈣化程度判定von kossa染色讀片標準[3]：背景為紅色，鈣鹽沉積為棕黑色。0分，無鈣鹽沉積；1分，點狀沉積；2分，單個片狀沉積；3分，多個片狀沉積；4分，彌漫性圍繞管腔沉積。根據評分結果，將病例組血管分為無鈣化組(0分)、輕度鈣化組(1～2分)、重度鈣化組(3～4分)，三組間年齡、性別差異無統計學意義。

1.5血管免疫組織化學結果 每個標本隨機取5個高倍鏡視野觀察。依照細胞陽性著色程度分級，弱陽性1分；中等強度2分；強陽性3分。依照陽性細胞總數分級為：<25%，≥25%且<49%，≥50%。采用積分綜合計量對每個標本進行評分分級。

1.6統計學處理采用SPSS 16.0 統計軟件進行分析，計量資料比較采用兩樣本比較t檢驗及單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法，血管鈣化程度與各血清指標之間的關系采用Spearman 相關分析，FGF-23和OPG與各指標之間的相關性采用Pearson 相關分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1兩組生化指標分析病例組血清FGF-23、OPG、P、iPTH、 CRP水平均明顯高于對照組，差異均有統計學意義(均P<0.05)。病例組血清Hb、ALB、Ca均明顯低于對照組，差異均有統計學意義(均P<0.05)，見表1。

2.2病例組血管鈣化情況36例糖尿病腎病尿毒癥患者橈動脈標本中，有16例發生鈣化(44.4%)，鈣化均發生在動脈中膜,其中輕度鈣化4例(11.1%)，中度鈣化8例(22.2%)，重度鈣化4例(11.1%),見圖1。在三組間比較，血P、FGF-23、OPG水平差異有統計學意義(P<0.05)。LED法組間比較重度鈣化組與輕度鈣化組差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表1　兩組各項生化指標的比較±s)

表2　不同橈動脈鈣化積分組的血清學指標比較±s)

2.3免疫組織化學分析在所有鈣化組標本中，橈動脈均可見FGF-23、OPG的表達，見圖2，3。重度鈣化組與輕度鈣化組陽性表達差異有統計學意義(P<0.05)。

2.4相關性分析Spearman 相關分析提示血清P、iPTH、CRP水平與血管鈣化呈正相關。Pearson 相關分析提示血清FGF-23、OPG水平與血P水平呈正相關，見表3。

表3　橈動脈鈣化積分與其他血清學指標的相關性分析

3討論

糖尿病導致的腎臟疾病是西方國家尿毒癥發病的最重要的病因。流行病學研究表明，糖尿病的患病率正逐年增加,在我國因糖尿病導致的腎臟病的發病率僅次于原發性慢性腎小球腎炎之后[4]。動脈血管中膜鈣化是慢性腎臟病患者最常見的并發癥，亦是尿毒癥患者因心血管疾病(CVD)死亡的主要預測因子[5]。超過50%的尿毒癥患者死于心血管意外[6]。糖尿病腎病尿毒癥患者因高血糖、高血脂、高血磷等復雜因素致血管內皮功能障礙，其血管鈣化發生率較慢性腎小球腎炎等導致的尿毒癥更早期、更常見[7]。

FGF-23是主要由骨細胞分泌的重要的血清磷調控蛋白，在腎臟的無機磷代謝中發揮重要作用，而血磷是導致血管鈣化的重要病理生理基礎。已有國外學者研究發現，FGF-23是影響尿毒癥患者血管鈣化的獨立影響因素，是尿毒癥患者死亡風險的獨立預測因子[8]。我們通過對糖尿病腎病尿毒癥患者橈動脈血管鈣化和血清FGF-23水平變化的研究，進一步探討糖尿病腎病尿毒癥患者FGF-23與血管鈣化的關系。

FGF-23可以通過抑制近端腎小管對磷的重吸收，并促進尿磷的排泄；同時抑制1α-羥化酶的活性，減少1,25(OH)2D3的合成，以減少腸道磷的吸收，從而調節血清中磷的動態平衡[9]。在正常人及有殘余腎功能的患者，尿中可發現有FGF-23的C肽片段，但在尿毒癥患者，隨著殘余腎功能的喪失，FGF-23的排泄率降低，其在血清水平逐漸升高，但此時即使較高濃度的血FGF-23水平，磷的清除也不會增加，導致高磷血癥。高磷血癥進一步刺激FGF-23明顯升高，升高的FGF-23使1,25(OH)2D3的合成減少，導致繼發性甲狀旁腺功能亢進癥。本研究結果顯示，糖尿病腎病尿毒癥患者的血清FGF-23明顯升高，與國外大量研究結果一致。

國外多個研究發現，尿毒癥患者血清OPG水平與血管鈣化程度呈正相關，是尿毒癥患者心血管病死率的獨立預測因子[10]。Moe等[11]的研究發現，尿毒癥患者血管鈣化程度與血清OPG濃度呈正相關。OPG可由骨骼細胞及血管內皮細胞產生，其可抑制破骨細胞生成，還抑制破骨細胞的骨吸收功能。現在越來越多的研究指向OPG的血管內皮功能維持和保護方面。其發揮作用可能是通過OPG-OPGL-RANK信號途徑進行調節的。動物實驗研究表明[12]，敲除小鼠OPG基因，使小鼠體內缺乏OPG。小鼠即表現出現嚴重的動脈血管鈣化及骨質疏松。但是在動物試驗中，予以重組骨保護素治療妊娠中期骨保護素基因缺乏小鼠治療可逆轉骨質疏松，而且這種基因型小鼠鈣化則被顯著抑制，血管鈣化發生率大大降低。故有學者認為[13]，OPG是血管保護因子，其通過防止血管鈣化起作用。但是有研究[14]發現尿毒癥患者及急性心肌梗死伴發心力衰竭患者血清OPG濃度升高，與本文研究結果相符，然而這似乎與OPG的血管保護作用相反。有研究[15]結果顯示，給以缺乏低密度脂蛋白(LDL)受體的小鼠高脂飲食，并檢測小鼠體內的OPG，發現其水平較前明顯升高，若再予以OPG治療，這些小鼠動脈鈣化水平較前明顯減輕。因此證實在血管鈣化、粥樣硬化及其他形式的血管受損的疾病中，OPG水平升高是機體對抗血管損害進一步進展的自我保護的代償機制，即OPG水平升高，不是導致動脈鈣化的原因，而是防止血管損害加重的保護機制[16]。在本實驗研究中，病例組血清OPG水平明顯高于對照組，且隨著橈動脈血管鈣化程度加重，血清OPG水平升高。本研究結果顯示，血清FGF-23、OPG水平與血管鈣化存在正相關關系，血清FGF-23、OPG參與了糖尿病腎病尿毒癥患者血管鈣化的發生發展，其是否是糖尿病腎病尿毒癥患者發生血管鈣化的預警指標值得我們進一步研究。

(本文圖1～3見插圖2-3)

參考文獻

[1]常明,劉紅,劉書馨,等.尿毒癥患者血管鈣化及相關因素的研究[J].中華腎臟病雜志,2006,22(9):578-579.

[2]Chiu YW,Adler S,Budoff M,et al.Prevalence and prognostic significance of renal artery calcification in patients with diabetes and proteinuria.[J].J Amer Soc Nephr,2010,5(11):2093-2100.

[3]王科,任偉,汪鵬,等.終末期腎臟病患者血清ucMGP及PIVKA—Ⅱ與橈動脈鈣化的相關性[J].安徽醫科大學學報,2014,49(4):505-508.

[4]王宓,王梅,李四君,等.慢性腎臟病5期非透析糖尿病與非糖尿病患者血管鈣化情況的比較 [J].中國血液凈化,2009,8(3):130-133.

[5]Sarnak MJ,Levey AS,Schoolwerth AC,et al.Kidney disease as a risk factor for development of cardiovascular disease: a statement from the american heart association councils on kidney in cardiovascular disease,high blood pressure research,clinical cardiology,and epidemiology and prevention[J].Hypertension,2003,42(17):2154-2169.

[6]Go AS,Chertow GM,Fan D,et al.Chronic kidney disease and the risks of death,cardiovascular events,and hospitalization.[J].N Engl J Med,2004,351(13):1296-1305.

[7]Taketani Y,Shuto E,Arai H,et al.Advantage of a low glycemic index and low phosphate diet on diabetic nephropathy and aging-related diseases [J].J Med Invest,2007,54(3/4):359-365.

[8]Nasrallah MM,El-Shehaby AR,Salem MM,et al.Fibroblast growth factor-23 (FGF-23) is independently correlated to aortic calcification in haemodialysis patients[J].Nephrol Dial Transplant,2010,25(8):2679-2685.

[9]Jüppner H,Wolf M,Salusky IB.FGF-23: More than a regulator of renal phosphate handling?[J].J Bone Miner Res,2010,25(10):2091-2097.

[10] Gábor S,Bertalan CF,Taha EHO,et al.Serum osteoprotegerin level,carotid-femoral pulse wave velocity and cardiovascular survival in haemodialysis patients[J].Nephrol Dial Transplant,2008,23(10):3256-3262.

[11] Moe SM,Martina R,Markus K,et al.Role of calcification inhibitors in the pathogenesis of vascular calcification in chronic kidney disease (CKD)[J].Kidney International,2005,67(6):2295-2304.

[12] Peng J,Li Y,Wang J,et al.Retracted: the effect of alendronate on the expression of osteopontin and osteoprotegerin in calcified aortic tissue of the rat[J].Eur J Pharmacol,2012,682(1/3):126-130.

[13] 徐美林,魏璇,張曉艷.骨保護素與冠狀動脈疾病的研究進展[J].中華心血管病雜志,2011,39(9):876-878.

[14] Rhee EJ,Lee WY,Kim SY,et al.Relationship of serum osteoprotegerin levels with coronary artery disease severity,left ventricular hypertrophy and C-reactive protein.[J].Clinical Science,2005,108(3):237-243.

[15] Sean M,Yin T,Zina Z,et al.Osteoprotegerin inhibits vascular calcification without affecting atherosclerosis in ldlr (-/-) mice[J].Circulation,2008,117(3): 411-420.

[16] Moldovan D,Kacso IM,Rusu C,et al.Role of osteoprotegerin in vascular disorders of the end-stage renal disease patients[J].Biomarkers,2015,20(2):116-122.

(收稿日期2015-11-17)

Correlation between FGF-23 and OPG,calcification of radial artery in patients with diabetic nephropathy with uremic

LiuJingjing,RenWei,WangKe,LanLei,WangDongmei

(DepartmentofNephrology，theAffiliatedProvincialHospitalofAnhuiMedicalUniversity，Hefei230001,China)Correspondingauthor:RenWei,Email:renweisn@163.com

[Abstract]ObjectiveTo explore the correlation between serum fibroblast growth factor-23 (FGF-23) and osteoprotegerin (OPG),calcification of radial artery in patients with diabetic nephropathy patients with uremia.MethodsThirty-six diabetic nephropathy with uremia (experimental group) who did not made dialytic were recruited in nephrology department of our hospital,and 40 healthy subjects (control group) were slected as control.Radial arteries tissue were saved in experimental group in arteriovenous fistula operation，and von kossa-staining was used to detect the degree of calcification.The level of serum FGF-23 and OPG was measured by enzyme-linked immunlsorbent assay.Serum concentrations of Hb,ALB,Ca,P,iPTH,HbA1c and CRP was measured.ResultsThe experimental group′s FGF-23 and OPG were significantly higher than those of the control group.FGF-23,OPG and their expression in radial artery were increased with vascular calcification .FGF-23 and OPG were associated with advanced vascular calcification in diabetic nephropathy with uremia.ConclusionRadial artery vascular calcification is almost universal in diabetic nephropathy with uremia,there is a positive relationship between serum FGF-23,OPG and vascular calcification.

[Key words]Diabetic nephropathies;Uremia;Osteoprotegerin;Vascular calcification

基金項目：安徽省年度重點科研項目(12070403059)；安徽省衛生廳立項課題(2010C040)

作者簡介：劉靜靜，碩士，Email:924675631@qq.com通訊作者：任偉，主任醫師，教授，碩士生導師，Email:renweisn@163.com

中圖分類號:R587.2

文獻標識碼:A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2016.02.021