口腔鱗狀細胞癌中PLK1蛋白表達與中心體擴增

李世靈　蔡　揚　于燕妮

（1　貴州省貴陽市婦幼保健院病理科　貴陽　550003；2　貴陽醫學院附屬醫院　貴州貴陽　550004）

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口腔鱗狀細胞癌中PLK1蛋白表達與中心體擴增

李世靈1蔡揚2#于燕妮2

（1貴州省貴陽市婦幼保健院病理科貴陽550003；2貴陽醫學院附屬醫院貴州貴陽550004）

摘要：目的：探討口腔鱗狀細胞癌（Oral Squamous Cell Carcinoma，OSCC）中保羅樣激酶-1（Polo-Like Kinase 1，PLK1）蛋白表達與中心體擴增之間的相關性。方法：采用免疫組化SABC法檢測10例正常口腔黏膜和47例OSCC中PLK1蛋白和γ-微管蛋白的表達情況，并分析兩者之間的相關性。結果：PLK1蛋白和γ-微管蛋白在正?？谇火つそM和OSCC組中的陽性表達率分別為0.0%（0/10）、70.2%（33/47）和0.0%（0/10）、76.6%（36/47），PLK1蛋白和γ-微管蛋白表達在正?？谇火つそM和OSCC組之間的差異均具有統計學意義，P＜0.05；Spearman相關分析顯示，OSCC組織中PLK1蛋白與γ-微管蛋白表達之間正相關，r=0.305，P＜0.05。結論：PLK1蛋白過表達可能是中心體擴增的潛在機制之一，PLK1蛋白過表達導致中心體擴增及細胞惡性增殖在OSCC發生中可能起一定的作用。

關鍵詞：口腔鱗狀細胞癌；保羅樣激酶-1；γ-微管蛋白；中心體擴增

基因不穩定是人類腫瘤發生發展的中心環節，染色體不穩定性（Chromosome Instability，CIN）作為基因不穩定的形式之一，是腫瘤細胞一個非常顯著的共同特征性表現。中心體異常被認為是染色體不穩定形成的潛在原因之一而與腫瘤發生有關。目前，中心體擴增可見人類大多數腫瘤中，其中也包括口腔鱗狀細胞癌（Oral Squamous Cell Carcinoma，OSCC）［1］，但其擴增機制仍不清楚。有研究提示保羅樣激酶-1（Polo-Like Kinase 1，PLK1）異常與中心體擴增、染色體不穩定及細胞惡性轉化密切相關［2～3］。γ-微管蛋白作為一個典型的中心體核心蛋白，對于細胞周期的調控發揮很大重要［4］。我們通過采用免疫組化SABC法檢測OSCC中PLK1蛋白和γ-微管蛋白的表達情況，初步探討兩者之間的相關性。

1　資料與方法

1.1臨床病理資料選取2000～2007年貴陽醫學院附屬醫院口腔科臨床活檢或手術切除標本，包括：經患者知情同意自阻生齒拔除時切除的正常牙齦黏膜組織10例、口腔黏膜上皮非典型增生組織29例（輕度14例，中度10例，重度5例）、OSCC組織47例（高分化33例，中分化11例，低分化3例；伴有淋巴結轉移者31例，無淋巴結轉移者16例；按2002 年WHO國際抗癌聯盟制定的腫瘤分期標準：Ⅰ期和Ⅱ期共9例，Ⅲ期和Ⅳ期共38例）。病人術前均未接受任何手術或化、放療治療。所有組織均經病理檢查確診。

1.2實驗試劑與方法

1.2.1實驗試劑鼠抗人PLK1單克隆抗體（購自美國Santa公司，SC-17783），鼠抗人γ-微管蛋白單克隆抗體（購自美國Sigma公司，GTU-88），免疫組化SABC試劑盒、抗原修復液及DAB顯色試劑盒（均購自武漢博士德生物技術有限公司）。

1.2.2實驗方法所有組織均經10%福爾馬林液固定后，制成蠟塊并切片，切片用APES溶液制成的膠片撈片，通過二甲苯脫臘，梯度酒精水化后，將切片置于修復液中（pH6.0，0.01 mol枸櫞酸鹽緩沖液），高壓熱修復3 min，待冷卻后用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗2次，5 min/次，滴加一抗（PLK1蛋白和γ-微管蛋白工作液稀釋度分別為1∶100和1∶200），在室溫孵育120 min；PBS液沖洗，滴加二抗，在室溫下孵育30 min，PBS液沖洗，最后用DAB顯色后蘇木素復染10 s，流水沖洗，梯度酒精脫水后封片。每批染色同時設置陽性和陰性對照：以已知陽性標本為陽性對照，以PBS液取代一抗作為陰性對照。免疫組化結果由兩位資深病理科醫師獨立判定取均值。

1.3結果判斷PLK1蛋白以細胞漿或細胞核著黃色顆粒或團塊為陽性染色，γ-微管蛋白以胞漿著黃色顆?；驁F塊為陽性染色。隨機選取上皮或腫瘤區的5個不同區域，觀察5個400倍高倍視野，計數陽性細胞數、陽性細胞百分率和評定顯色強度，依照陽性細胞百分率＜5%，5%～25%，25%～50%，50%～75%，＞75%分別得0、1、2、3、4分；依照顯色強度未著色、淺黃色、棕黃色、棕褐色分別得0、1、2、3分，兩項得分相乘，并取5個高倍視野得分的平均值。按照分數分為4個等級：0～3為陰性（－），4～6為低表達（+），7～8為中表達（++），9分以上為高表達（+++）。（+）、（++）和（+++）的病例均歸為陽性。

1.4統計學處理數據處理采用SPSS13.0統計軟件，進行χ2檢驗、Fisher's確切概率法和Spearman相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1PLK1蛋白在正?？谇火つそM織和OSCC中的表達情況PLK1蛋白在正常口腔黏膜組中未見陽性表達，在OSCC組中的陽性表達率達為70.2% （33/47），中、高表達共28例。PLK1蛋白陽性表達率在OSCC組顯著高于正?？谇火つそM，P＜0.05。見圖1～圖2。

圖1　PLK1蛋白在正?？谇火つそM織中的陰性表達（SABC×400）

圖2　PLK1蛋白在口腔鱗癌組織中的陽性表達（SABC×400）

2.2γ-微管蛋白在正?？谇火つそM織和OSCC中的表達情況γ-微管蛋白在正?？谇火つど掀せ讓觾H見極少數基底細胞胞漿陽性著色，按標準判為陰性表達；而在OSCC組織中的陽性表達率為76.6%（36/47），陽性細胞以中、高度表達為主呈大量散在分布，有的甚至滿布視野。γ-微管蛋白表達在正常口腔黏膜組與OSCC組比較差異有統計學意義，P＜0.05。見圖3～圖4。

圖3　γ-微管蛋白在正常口腔黏膜組織中的陰性表達（SABC×1000）

圖4　γ-微管蛋白在口腔鱗癌組織中的陽性表達（SABC×1000）

2.3PLK1與γ-微管蛋白表達之間的相關性Spearman相關分析顯示，OSCC組織中PLK1蛋白表達與γ-微管蛋白表達之間正相關，r=0.305，P＜0.05。見表1。

表1　口腔鱗癌組織中PLK1與γ-微管蛋白表達之間的相關性分析（例）

3　討論

中心體異?？杀憩F為中心體數目擴增、結構異常、中心粒周圍物質聚集過多、中心體蛋白的異常磷酸化、無粒中心體、微管成核能力增強等［4］。中心體由中心粒和中心粒周圍物質（Pericentriolar Materia，PCM）兩部分組成，目前的相關研究提示中心體上恒定存在的蛋白（也即核心蛋白，指的是在用各種方法解聚微管之后它們的中心體定位并不會受影響）并不多，而γ-微管蛋白就是一個典型的中心體核心蛋白［5］，主要以γ-微管蛋白環式復合體（γ-Tubulin Ring Complex，γ-TuRC）和γ-微管蛋白小復合體（γ-Tubulin Small Complex，γ-TuSC）兩種形式存在，γ-TuRC和γ-TuSC能與一些γ-微管蛋白復合體結合蛋白結合，錨定在微管組織中心參與微管成核起始。研究發現，向微管蛋白溶液中加入γ-TuRC，能夠引起微管蛋白的聚集，微管成核能力隨著γ-TuRC的濃度的增加呈線性增長［6］。Iemura K等［7］研究發現通過Western blot方法測定細胞中γ-微管蛋白的平均含量可以用來評價中心體擴增情況。本研究應用免疫組化的方法以γ-微管蛋白的單克隆抗體在OSCC細胞中的表達情況來評價中心體擴增情況，發現其結果與盧紅等［8］應用免疫熒光方法檢測OSCC組織中中心體擴增情況相似。

中心體上除了γ-微管蛋白等核心蛋白之外還存在隨著細胞周期的改變而被中心體核心蛋白直接或間接招募到中心體上的一些調控因子，PLK1就是這些眾多調控因子之一［9］。PLK1是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，是細胞周期相關事件包括雙極紡錘體形成、染色體分離和中心體成熟的重要調控因子［10～11］。大量研究發現，PLK1在許多惡性腫瘤中呈高表達，并與腫瘤的某些生物學行為密切相關［12～13］，提示PLK1可能在惡性腫瘤轉化過程中發揮重要作用。本研究中，正?？谇火つそM織未見PLK1蛋白陽性表達，而在OSCC中其陽性表達率為70.2%（33/47），以中、高度表達為主。本研究及相關報道說明，PLK1過表達確實普遍存在于實體腫瘤組織中，包括OSCC組織［14］。

癌細胞中過量的中心體可能導致染色體的錯誤分類及破壞，形成非整倍體性染色體，可導致腫瘤抑制基因的丟失，活化致癌基因［15］，故認為中心體可能是癌癥形成的驅動力量而非結果，而PLK1對中心體成熟的必要性可能是其致癌作用的一種機制。中心體成熟實際上是γ-TuRC和其他的PCM向中心體聚集的過程。γ-TuRC的形成依賴于PLK1，但其完整的機制還并不清楚。有報道稱［16］，作為γ-TuRC成員之一的Nedd1的磷酸化可能起到了重要的作用。Nedd1首先被CDK磷酸化，形成于一個與PLK1結合的區域，然后PLK1相繼磷酸化Nedd1的另外4個位點，促進其與γ-tubulin的結合，以此決定γ-TuRC在中心體的募集。Yamamoto Y等［17］發現，發生PLK1過表達的膀胱癌與沒有發生PLK1過表達的膀胱癌相比較，前者更易發生中心體擴增。本研究發現，在OSCC組織中，PLK1陽性表達與γ-微管蛋白表達之間正相關，r=0.305，P＜0.05，推測PLK1過表達可能通過直接調控中心體組分或對中心體相關蛋白磷酸化作用失調，而引發OSCC中心體擴增，從而導致異常紡錘體極形成和染色體分離錯誤，最終導致OSCC的形成。

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·臨床研究·

PLK1 Protein Expression and Centrosome Amplification in Oral Squamous Cell Carcinoma

LI Shi-ling1，CAI Yang2#，YU Yan-ni2
（1 Department of Pathology，Maternal and child health-care hospital of Guiyang City，Guiyang，Guizhou 550003；2 The Affiliated Hospital of Guiyang Medical College，Guiyang，Guizhou 550004）

Abstract:Objective: To study the correlation between polo-like kinase 1 protein expression and centrosome amplification in oral squamous cell carcinoma. Methods: The expressions of PLK1 and γ-tubulin proteins in 10 cases of normal oral mucosa and 47 cases of oral squamous cell carcinoma were investigated by SABC method，and analyzed the correlation between them. Results: Rate of positive expression of Plk1 protein and γ-tubulin in normal oral mucosa group and OSCC group were 0%（0/10），70.2%（33/47）and 0%（0/10），76.6%（36/47）respectively，and differences of Plk1 protein and γ-tubulin expression between OSCC group and normal oral mucosa group were statistically significant，P＜0.05. Spearman correlation analysis showed that the expression of PLK1 protein in OSCC tissue was positively correlated with the expression of gamma tubulin，r=0.305，P＜0.05. Conclusion: Over-expression of PLK1 protein may be a potential mechanism of centrosome amplification，while PLK1 protein leads to centrosome amplification and cell proliferation may play a role in the occurrence of OSCC expression.

Key words:Oral squamous cell carcinomas；Polo-like kinase 1（PLK1）；γ-Tubulin protein；Centrosome amplification

#通信作者：蔡揚，Email：caiyang85@163.com

中圖分類號：R780.2

文獻標識碼：B

doi:10.13638/j.issn.1671-4040.2016.03.002

收稿日期：（2016-02-21）