干擾素聯合利巴韋林對慢性丙型肝炎患者CD8+ T細胞亞群功能的影響*

平　玉，李志勤，王　盟，胡金星，張　震，黃　嵐，張　毅#

1)鄭州大學第一附屬醫院生物細胞治療中心 鄭州 450052　2)鄭州大學生命科學學院 鄭州 450001　3)鄭州大學第一附屬醫院感染科 鄭州 450052　4)鄭州大學第一附屬醫院消化內科 鄭州 450052

干擾素聯合利巴韋林對慢性丙型肝炎患者CD8+T細胞亞群功能的影響*

平玉1,2)，李志勤3)，王盟4)，胡金星3)，張震1)，黃嵐1)，張毅1,2)#

1)鄭州大學第一附屬醫院生物細胞治療中心 鄭州 4500522)鄭州大學生命科學學院 鄭州 4500013)鄭州大學第一附屬醫院感染科 鄭州 4500524)鄭州大學第一附屬醫院消化內科 鄭州 450052

關鍵詞干擾素；利巴韋林；慢性丙型肝炎；CD8+ T細胞

摘要目的：探討干擾素聯合利巴韋林對慢性丙型肝炎患者外周血中CD8+ T細胞亞群功能的影響。方法：密度梯度離心法從慢性丙型肝炎患者外周血中獲取外周血單個核細胞，體外給予干擾素和(或)利巴韋林處理。用流式細胞術檢測外周血單個核細胞中CD8+ T細胞分泌干擾素γ和穿孔素(Perforin)的水平；用實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測外周血單個核細胞中干擾素相關基因IRF7和IFIT1的表達。結果：細胞內因子檢測發現干擾素聯合利巴韋林處理能增加CD8+ T細胞中效應性T細胞分泌干擾素γ和Perforin的水平(P<0.05)，同時能增加中心記憶性T細胞和效應記憶性T細胞分泌Perforin的水平(P<0.05)；基因轉錄水平的檢測發現干擾素聯合利巴韋林處理后干擾素調節基因IFIT1的表達增加(P<0.05)。結論：慢性丙型肝炎患者的外周血單個核細胞體外經干擾素聯合利巴韋林處理后，CD8+ T細胞的殺傷功能增強。

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)引起的[1]，可分為急性丙型肝炎和慢性丙型肝炎。HCV在機體內的持續存在是引起慢性丙型肝炎的主要原因[1]。大量研究[2-3]表明，CD8+T細胞在控制病毒復制及感染的過程中發揮著重要的作用，然而在慢性丙型肝炎患者中大部分CD4+T細胞和CD8+T細胞都出現功能失調的現象。這說明HCV能直接或間接抑制T細胞功能的發揮。目前，臨床上干擾素聯合利巴韋林是治療慢性丙型肝炎的常用方案。近年來，一系列小分子藥物的出現，為慢性丙型肝炎的治療帶來了曙光[4-5]。然而，由于這些小分子藥物只在部分發達國家廣泛應用，在我國慢性丙型肝炎的治療仍以干擾素聯合利巴韋林為標準。該研究以初治慢性丙型肝炎患者為研究對象，在體外從細胞學的角度觀察干擾素及利巴韋林對CD8+T細胞亞群功能的影響。

1材料與方法

1.1材料收集2014年8月至2015年8月鄭州大學第一附屬醫院收治的慢性丙型肝炎患者的外周血。所有病例均為初治慢性丙型肝炎患者，入院前未進行任何抗病毒治療。RPMI 1640培養基、胎牛血清購自HyClone公司，人外周血淋巴細胞分離液購自天津灝陽公司，SYBR GREEN染料和Trizol購自TaKaRa公司，流式熒光抗體均購自BD公司，CD8磁珠購自美天妮公司，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2外周血單個核細胞的分離 取一支50 mL離心管，將10 mL血加入到離心管中，加生理鹽水稀釋至20 mL；另取一支50 mL離心管，加入10 mL的人外周血淋巴細胞分離液；用無菌吸管小心地將稀釋后的血液緩緩加于淋巴細胞分離液的液面上；18～22 ℃、2 500 r/min離心20 min；然后用無菌吸管小心吸取淋巴細胞層于另一個無菌的離心管中，加入適量生理鹽水，1 500 r/min離心10 min；然后棄上清，再加入適量的生理鹽水重懸細胞，1 500 r/min離心10 min，得到的沉淀即外周血單個核細胞。

1.3外周血單個核細胞體外處理及培養提取的外周血單個核細胞鋪于24孔板中，每孔1×106個細胞，設置4組，分別是對照組、干擾素處理組、利巴韋林處理組和干擾素聯合利巴韋林處理組(簡稱聯合處理組)。人重組干擾素α-2a的濃度為10 U/L，利巴韋林的濃度為100 mg/L，各組加藥處理時間均為12 h。密度梯度離心法得到的外周血單個核細胞體外加藥處理12 h后，以CCR7和CD45RA來鑒定CD8+T細胞的4個亞群：CCR7-CD45RA-的CD8+T細胞為效應記憶性T細胞(TEM)；CCR7+CD45RA-的CD8+T細胞為效應性T細胞(TEMRA)；CCR7-CD45RA+的CD8+T細胞為中心記憶性T細胞(TCM)；CCR7+CD45RA+的CD8+T細胞為初始T細胞(NC)[6]。

1.4細胞內因子檢測每孔細胞加藥處理12 h后，分別加入PMA(50 mg/L)、離子霉素(750 mg/L)、阻斷劑，刺激6 h左右。將24孔板里的細胞置于1.5 mL的離心管中，用生理鹽水清洗2遍，避光，加表面抗體CD3-PE-cy7、CD8-Percp、CCR7-PE、CD45RA-FITC，4 ℃孵育20 min；加200 μL固定劑，4 ℃避光孵育30 min；加400 μL破膜劑，4 ℃避光孵育1 h；加胞內抗體干擾素γ-APC和穿孔素(Perforin)-APC-cy7，4 ℃避光孵育30 min。上流式細胞儀檢測細胞分群及細胞因子分泌情況。實驗重復3次。

1.5磁珠分選將加藥處理后的細胞置于離心管中，用磁分選緩沖液洗2遍。計數細胞，每1×107個細胞中加20 μL的CD8磁珠和80 μL的磁分選緩沖液，4 ℃孵育20 min。孵育后離心管中加適量磁分選緩沖液，1 500 r/min離心10 min，同時將柱子置于磁場中，用磁分選緩沖液潤濕一下；離心后，加1 mL磁分選緩沖液重懸細胞，將細胞懸液緩緩打入柱子中；待柱子中的細胞懸液滴完后，加磁分選緩沖液洗柱子3遍；最后，將柱子里的細胞通過注射器施壓打入到另一無菌的離心管中，得到的細胞為CD8+T細胞。

1.6實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測干擾素調節基因IRF7、IFIT1的表達[7-8]內參GAPDH的引物序列為：上游5’-GGAGCCAAAAGGGTCATCATCTC-3’，下游5’-GAGGGGCCATCCACAGTCTTCT-3’；IRF7的引物序列為：上游5’-GCTGGACGTGACCATCATG TA-3’，下游5’-GGGCCGTATAGGAACGTGC-3’；IFIT1的序列為：上游5’-TTGATGACGATGAAATGCCTGA-3’，下游5’-CAGGTCACCAGACTCCTCAC-3’。 磁分選得到的CD8+T細胞離心取沉淀；將沉淀用1 mL的Trizol重懸，提RNA，反轉錄；以2 μL cDNA為模板，加10 μL SYBR GREEN染料、1 μmol/L的上下游引物各4 μL，共20 μL反應體系。反應條件為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s,72 ℃ 10 s，共40個循環；72 ℃ 10 min。均設3個復孔，結果以2-ΔΔCt表示。

1.7統計學處理采用SPSS 17.0進行數據分析。不同組間干擾素γ、Perforin及IRF7、IFIT1 mRNA相對表達量的比較均采用2×2析因設計的方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1干擾素聯合利巴韋林對CD8+T細胞4個亞群比例的影響結果見表1。

表1　4組中CD8+ T細胞4個亞群的比例　%

2.2干擾素聯合利巴韋林對CD8+T細胞4個亞群干擾素γ分泌的影響結果見表2。

表2　4組中CD8+ T

2.3干擾素聯合利巴韋林對CD8+T細胞4個亞群Perforin分泌的影響結果見表3。

表3　4組中CD8+ T

2.4干擾素聯合利巴韋林對CD8+T細胞干擾素調節基因IRF7、IFIT1表達的影響結果見表4。

表4　4組IRF7和IFIT1基因的表達

3討論

該研究通過體外給予干擾素及利巴韋林，探究其對CD8+T細胞亞群功能的影響。體外聯合給藥后，慢性丙型肝炎患者中CD8+T細胞各亞群的功能都有所改善，為臨床上的有效治療提供了實驗基礎。然而，盡管機體產生了這些反應，HCV仍然能夠在肝組織內復制，引起肝組織的損傷[9]。在慢性丙型肝炎患者中，病毒能夠不斷復制，CD8+T細胞以及CD4+T細胞處于功能缺失的狀態[9]。而CD8+T細胞效應功能在病毒的清除及疾病的進展過程中發揮著至關重要的作用。Wang等[10]研究發現，干擾素γ高表達CD38低表達的CD8+T細胞能夠有效清除病毒，相反的，干擾素γ低表達CD38高表達與肝組織的損傷及炎癥的持續存在有密切的關系。Jo等[11]研究發現，Perforin在病毒感染的過程中能夠調節CD8+T細胞對靶細胞的殺傷。該研究發現，慢性丙型肝炎患者外周血單個核細胞在干擾素聯合利巴韋林處理后T細胞分泌殺傷性因子干擾素γ和Perforin升高，證明這種T細胞無能的狀態在體外給予干擾素和利巴韋林處理后能夠改善，如CD8+T細胞的4個亞群的比例有所變化，功能有所提高。

Thomas等[8]研究發現，利巴韋林與干擾素聯合治療能夠顯著升高干擾素調節基因的表達。然而，該研究發現，與對照組相比，體外給予干擾素和利巴韋林后，干擾素調節基因IRF7表達升高，但差異無統計學意義；IFIT1的表達升高，且差異有統計學意義，但是與干擾素處理組相比，聯合處理組IFIT1的表達有降低的趨勢，與Thomas等[8]的研究發現不一致。Wieland等[12]研究發現病毒感染能夠使細胞中干擾素調節基因表達升高。基于該研究，作者認為聯合處理組IFIT1的表達低于干擾素處理組可能與利巴韋林能夠抑制病毒在細胞中的復制有關，進而使IFIT1的表達降低。該研究發現體外聯合使用干擾素和利巴韋林后，慢性丙型肝炎患者CD8+T細胞中TEMRA亞群干擾素γ和Perforin的分泌量增加。結合相關研究[8]，作者認為干擾素影響CD8+T細胞的功能可能是通過信號轉導子和轉錄激活子信號通路來實現的。

綜上所述，該研究發現，與對照組相比，體外給予干擾素和利巴韋林后，慢性丙型肝炎患者CD8+T細胞4個亞群的比例有升高的趨勢，但差異無統計學意義，TEMRA亞群中干擾素γ和Perforin的分泌量增加，同時，也上調了干擾素調節基因IFIT1的表達。體外進一步研究臨床抗病毒藥物對CD8+T細胞功能影響的相關機制，可為以后慢性丙型肝炎的治療提供更為有力的實驗依據，并為小分子抑制藥物的研究與開發提供一定的實驗基礎。

參考文獻

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Effect of interferon plus ribavirin on CD8+T cells function in patients with chronic hepatitis C virus infection

PINGYu1,2),LIZhiqin3),WANGMeng4),HUJinxing3),ZHANGZhen1),HUANGLan1),ZHANGYi1,2)

1)BiotherapyCenter,theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500522)SchoolofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500013)DepartmentofInfectiousDiseases,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500524)DepartmentofGastroenterology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordsinterferon;ribavirin;chronic hepatitis C;CD8+ T cell

AbstractAim: To evaluate the function of CD8+ T cells from patients with chronic hepatitis C virus after treated with interferon plus ribavirin.Methods: Peripheral blood mononuclear cells were isolated from whole blood by density gradient centrifugation and seeded into 24-well plate before treatment with interferon and(or) ribavirin. The secretion of IFN-γ and Perforin was detected by flow cytometry. Real time PCR was used to detect the expression of interferon regulatory factors IRF7 and IFIT1.Results: Compared with control, being treated with interferon plus ribavirin could increase the levels of INF-γ and Perforin secreted by effective T cells(P<0.05).In addition, Perforin secreted by effect memory T cells and centre memory T cells also increased(P<0.05). The expression of interferon regulatory factor IFIT1 up-regulated simultaneously(P<0.05).Conclusion: Interferon plus ribavirin may enhance the function of CD8+ T cells.

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.03.008

#通信作者，男，1964年4月生，博士，教授，研究方向：腫瘤免疫，E-mail：yizhang@zzu.edu.cn

中圖分類號R392.12

*國家自然科學基金面上項目81271815