低能激光照射對大鼠心肌梗死后miRNA-21表達的影響>*

馬　超，法憲恩，柳　兵，周玉陽，黃真鋒，余海彬

鄭州大學第二附屬醫院心血管外科 鄭州 450014

低能激光照射對大鼠心肌梗死后miRNA-21表達的影響>*

馬超，法憲恩#，柳兵，周玉陽，黃真鋒，余海彬

鄭州大學第二附屬醫院心血管外科 鄭州 450014

關鍵詞低能激光照射；大鼠；心肌梗死；miRNA-21；心肌保護

摘要目的：觀察低能激光照射(LLLI)對大鼠心肌梗死區及其邊緣組織中miRNA(簡稱miR)-21表達的影響。方法：將110只SD大鼠分為假手術組(30只)、對照組(40只)和治療組(40只)。對照組和治療組通過結扎左冠狀動脈前降支制作心肌梗死模型，假手術組同部位只穿線不結扎，3周后治療組采用LLLI處理梗死區域，對照組和假手術組照射同一區域但治療儀不接通電源，各組分別于照射后1 h、24 h、48 h、72 h、7 d取梗死及邊緣組織，采用RT-PCR法檢測miR-21的表達。結果：梗死中心和邊緣區比較，不同組別之間miR-21表達量比較差異有統計學意義(P<0.001)，處理后不同時間miR-21表達量比較差異有統計學意義(P<0.001)；治療組梗死區miR-21的表達在LLLI處理后各時間點的表達量均高于對照組(P<0.05)；治療組梗死邊緣miR-21的表達量在48 h達到峰值，且不同時間點的表達量均高于對照組和假手術組(P<0.05)。結論：LLLI處理梗死心肌能有效上調梗死及邊緣區域miR-21的表達，有較好的心肌保護作用。

低能激光照射(low-level laser irradiation，LLLI)在生命科學領域已有60多年歷史[1]，是一項比較成熟的物理療法。此療法是使用輸出功率為毫瓦級的低能量在未損傷組織的情況下，對靶組織進行調節、活化等生物學刺激，以促進傷口愈合、降低炎癥反應、增強線粒體代謝、加速ATP的合成、改善細胞增殖等。近些年，Yang等[2]研究表明LLLI可以增加大鼠心肌梗死后左心室室壁厚度，減少心肌中膠原纖維組織生成，改善心室重塑過程。有學者[1]指出LLLI可以改善梗死區組織微環境，減小心肌梗死面積。該實驗使用低能激光處理大鼠心臟梗死區，觀察心肌組織中miRNA(簡稱miR)-21的表達，探討LLLI處理對心肌組織的保護作用。

1材料與方法

1.1材料成年雌性SD大鼠110只，體重220～250 g，由河南省實驗動物中心提供，所有的動物實驗均得到鄭州大學第二附屬醫院動物委員會的批準。主要試劑、儀器：生物信號采集與分析系統BL-420S型、小動物呼吸機HX-100E型(成都泰盟科技有限公司)；超聲心動圖機Sonos 5500型(荷蘭Philips公司)；激光治療儀TY-1型(北京天佑科儀科技有限公司)；Trizol試劑(美國Invitrogen公司)；冷凍離心機2-16K型(德國Sigma公司)；7500 Fast RT-PCR System(美國Applied Biosystems公司)。

1.2實驗分組SD大鼠采用隨機數字表法分為3組：假手術組(30只)、對照組(40只)、治療組(40只)。對照組和治療組通過結扎左冠狀動脈前降支制備心肌梗死模型，假手術組同部位穿線但不結扎。

1.3心肌梗死模型制作方法對SD大鼠進行稱重，水合氯醛腹腔注射麻醉，剔除頸部和左胸的毛發，切開頸部皮膚，分離皮下組織，行氣管切開呼吸機輔助呼吸，在胸骨左緣心尖搏動最強處切開皮膚，鈍性逐層分離肌組織，使用眼科剪小心剪開第3～4肋間，開瞼器撐開肋間，充分暴露左心耳及周圍區域，用紗布壓墊肺臟，在心臟表面噴灑0.05 mL體積分數2%利多卡因注射液預防心律失常，使用5-0無損傷縫合線從左心耳下1～2 mm進針，肺動脈圓錐旁出針，結扎后觀察左室壁運動減弱、顏色變為白色、心電圖ST段抬高才能確定心肌梗死模型制備成功。待心電穩定之后抽出胸腔內氣體，逐層關胸，防止漏氣，拔出氣管插管，擠壓大鼠胸部，待呼吸正常后縫合氣管及頸部皮膚。注意術后保溫，直至大鼠蘇醒，抗生素肌內注射3 d，并保證充足的飲食供應[3]。

1.4心肌梗死模型的篩選模型制備3周后，超聲心動圖檢查大鼠心臟，心肌梗死模型的入選標準[4]：①左室射血分數<60%；②左室短軸縮短率<30%；③超聲科醫生判斷有1個或者多個層面出現前壁室壁收縮異常的表現。至少符合上述2項方可入選。

1.5LLLI處理心肌梗死模型建立后3周，對梗死模型進行LLLI處理。開胸方法同上，但此次剪開第5肋間隙，開瞼器固定，暴露心臟，在距梗死區心肌表面15 mm處使用二極管激光治療儀(功率6 mW，波長635 nm)照射，持續時間為125 s，此時心肌所接受的激光能量密度為0.96 J/cm2，3組均進行照射，但假手術組、對照組照射時不接通電源。

1.6心肌梗死區及邊緣區miR-21表達的檢測各組均在低能激光處理后1 h、24 h、48 h、72 h、7 d腹腔注射麻醉，氣管插管，迅速開胸獲取心臟，置入4 ℃生理鹽水中隨心搏排空腔內血液，采集梗死及邊緣區域組織，放入-80 ℃冰箱保存?？俁NA提取參照Trizol試劑盒說明書進行操作。每一個樣本提取1 μg總RNA，逆轉錄合成cDNA。miR-21引物序列：上游5’-CCTGCCTGAGCACCTCGTGC-3’，下游5’-GACTGTGACGACTACCCCAA-3’，擴增片段大小75 bp；內參U6引物序列：上游5’-CTCGCTTCG GCAGCACA-3’,下游5’-AACGCTTCACGAATTT GCGT-3’，擴增片段大小109 bp。PCR反應條件：95 ℃ 5 min，然后95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s 40個循環，再從60 ℃加熱至95 ℃獲得相應的融解曲線。反應過程中未加入逆轉錄酶或cDNA模板者作為陰性對照，每個反應體系設3個復孔。采用2-ΔΔCT法分析miR-21的相對表達量。

1.7統計學處理采用SPSS 19.0進行數據分析，不同組間miR-21相對表達量的比較采用析因設計的方差分析，檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1心肌梗死模型制作成功率制備模型后3周，對照組和治療組共剩69只(86.3%)大鼠，死亡原因有不可恢復的心律失常、術中嚴重肺臟損傷、心臟破裂、氣管分泌物過多、術后心力衰竭等。經過超聲篩選，共有53只(66.3%，對照組26只、治療組27只)符合標準。

2.2梗死區miR-21的表達結果見表1。

表1　處理后不同時間各組大鼠梗死區miR-21相對表達量的比較

F組間=773.200，F時間=160.300，F交互=79.700，P均<0.001；*：與假手術組比較，P<0.05；△：與對照組比較，P<0.05。

2.3梗死邊緣區miR-21的表達結果見表2。

表2　處理后不同時間各組大鼠梗死邊緣區miR-21相對表達量的比較

F組間=156.600，F時間=16.700，F交互=7.200，P均<0.001；*：與假手術組比較，P<0.05；△：與對照組比較，P<0.05。

3討論

LLLI主要通過“光生物刺激”對靶組織進行治療，對靶組織照射并不會產生顯著的“熱效應”，此療法安全性高，操作簡便，成本低廉，已被臨床廣泛接受。Yang等[5]發現，低能激光的密度為0.96 J/cm2時能夠有效發揮心肌保護作用，減少心肌梗死的面積。該實驗中選擇距離心臟表面15 mm進行照射，波長635 nm，功率6 mW，持續時間125 s，此時的能量密度為0.96 J/cm2。

多項實驗[6]證實miR參與了心肌梗死后的心臟重塑過程，并且miR的表達與非缺血性心肌病、心律失常、動脈粥樣硬化、心肌再生都有密切關系，miR很可能被當作新型的生物治療劑。miR-21是由單個基因編碼，位于染色體17q23.2，高度保守[7-8]。起初由于miR-21在多種癌組織中過表達[9]，而被形容為致癌miR。隨著研究的深入，miR-21參與心臟結構重塑已引起廣泛關注。Kumarswamy等[10]發現在小鼠壓力負荷心臟纖維化模型中，miR-21表達的上調可減緩內皮細胞向間質轉化，從而部分阻斷纖維化的進程。Tu等[11]研究證實，上調miR-21通過PTEN/Akt信號通路抑制細胞凋亡，可以起到心肌保護作用。Liang等[12]揭示了miR-21和TGFβRⅢ在心肌纖維化過程中存在相互抑制關系，而TGFβRⅢ是miR-21特異性靶點。

關于LLLI治療心肌梗死已經有很多學術成果。如楊繼濤等[13]發現LLLI處理梗死的心肌能夠顯著降低組織中丙二醛的表達量，提高超氧化物歧化酶的活性，有效改善心室重塑過程。Tuby等[14]揭示了LLLI能夠提高血管內皮生長因子和誘導型一氧化氮合酶的表達，促進血管再生，改善梗死區微循環，有較好的心肌保護作用。該實驗結果顯示，對照組在LLLI處理后不同時間，梗死區miR-21表達低于假手術組，邊緣區miR-21表達高于假手術組，與Gu等[15]報道相符。治療組梗死區及邊緣區不同時間miR-21的表達均高于對照組，說明LLLI處理梗死及周邊區能夠上調照射區域內心肌細胞miR-21的表達。

心臟結構重塑是心血管疾病發生的關鍵過程，可伴隨心房顫動、心力衰竭、心肌梗死等疾病[16-18]，miR-21可延緩心肌纖維化，抑制細胞凋亡。LLLI處理梗死區及周邊心肌可以安全、高效、特異地上調miR-21的表達，起到心肌保護作用，但調節機制仍需要進一步研究。

參考文獻

[1]侯劍峰,袁昕,張浩,等.低能激光照射對梗死后心肌微環境影響的實驗研究[J].中國循環雜志,2015,30(1):47

[2]YANG J,HUANG Z,ZHOU Y,et al.Effect of low-level laser irradiation on oxygen free radicals and ventricular remodeling in the infarcted rat heart[J].Photomed Laser Surg,2013,31(9):447

[3]馬超,法憲恩,柳兵,等.非呼吸機輔助呼吸下大鼠心梗模型的建立[J].中華實驗外科雜志,2015,32(6):1284

[4]付倩,謝明星,王靜,等.二維應變超聲心動圖評價大鼠急性心肌梗死模型局部心肌功能改變的應用價值[J].中華超聲影像學雜志,2009,18(12):1071

[5]YANG Z,WU Y,ZHANG H,et al.Low-level laser irradiation alters cardiac cytokine expression following acute myocardial infarction: a potential mechanism for laser therapy[J].Photomed Laser Surg,2011,29(6):391

[6]BIASUCCI LM,CARDILLO MT.MicroRNA and myocardial infarction:a mystery turning into glory？[J].J Am Coll Cardiol,2013,62(11):999

[7]FUJITA S,ITO T,MIZUTANI T,et al.miR-21 gene expression triggered by AP-1 is sustained through a double-negative feedback mechanism[J].J Mol Biol,2008,378(3):492

[8]樊清波,李小威,簡立國,等.三七總皂苷對大鼠心肌梗死后血管新生及微小 RNA-21表達的影響[J].鄭州大學學報(醫學版),2014,49(1):48

[9]阮志敏,武力勇,朱國富,等.microRNA-21與冠心病的相關性研究[J].臨床心血管病雜志,2015,31(1):50

[10]KUMARSWAMY R,VOLKMANN I,JAZBUTYTE V,et al.Transforming growth factor-β-induced endothelial-to-mesenchymal transition is partly mediated by microRNA-21[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2012,32(2):361

[11]TU Y,WAN L,FAN Y,et al.Ischemic postconditioning-mediated miRNA-21 protects against cardiac ischemia/reperfusion injury via PTEN/Akt pathway[J].PLoS One,2013,8(10):e75872

[12]LIANG H,ZHANG C,BAN T,et al.A novel reciprocal loop between microRNA-21 and TGFβRⅢ is involved in cardiac fibrosis[J].Int J Biochem Cell Biol,2012,44(12):2152

[13]楊繼濤,法憲恩,周玉陽,等.低能激光照射對大鼠梗死心肌組織中超氧化物歧化酶和丙二醛的影響[J].中華實驗外科雜志,2013,30(4):759

[14]TUBY H,MALTZ L,ORON U.Modulations of VEGF and iNOS in the rat heart by low level laser therapy are associated with cardioprotection and enhanced angiogenesis[J].Lasers Surg Med,2006,38(7):682

[15]GU GL,XU XL,SUN XT,et al.Cardioprotective effect of microRNA-21 in murine myocardial infarction[J].Cardiovasc Ther,2015,33(3):109

[16]蔣偉,法憲恩,李曉召.竇房結細胞裂解液對大鼠骨髓間充質干細胞的誘導分化作用[J].鄭州大學學報(醫學版),2011,46(1):79

[17]宋先忠,張華,王俊生,等.冠脈搭橋術同期經心肌注射移植自體骨髓單個核細胞治療心肌梗死效果觀察[J].鄭州大學學報(醫學版),2011,46(1):131

[18]ZHANG H,HOU JF,SHEN Y,et al.Low level laser irradiation precondition to create friendly milieu of infarcted myocardium and enhance early survival of transplanted bone marrow cells[J].J Cell Mol Med,2010,14(7):1975

Effects of low-level laser irradiation on miRNA-21 expression in rats with myocardial infarction

MAChao,FAXian′en,LIUBing,ZHOUYuyang,HUANGZhenfeng,YUHaibin

DepartmentofCardiovascularSurgery,theSecondAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014

Key wordslow-level laser irradiation;rat;myocardial infarction;miRNA-21;cardioprotection

AbstractAim: To observe the effects of low-level laser irradiation(LLLI) on miRNA(miR)-21 expression in myocardial infarct area and the edge tissue.Methods: A total of 110 SD rats were randomly allocated into sham operation group(30 rats), control group(40 rats), and the treatment group(40 rats).Myocardial infarction model in control and treatment groups was made by ligation of the left anterior descending coronary artery.After three weeks the treatment group was given LLLI, the control group and the sham operation group was irradiated at the same site but the device did not power on.At 1 h, 24 h, 48 h, 72 h, 7 d after irradiation, miR-21 expression was detected using RT-PCR.Results: miR-21 expression was significantly different between different groups and between the center and edge of the infarct area(P<0.001), miR-21 expression at different time points after treatment also had significant difference(P<0.001). The expression of miR-21 in the treatment group was higher than that in the control group at each time point after LLLI treatment(P<0.05), miR-21 expression level peaked at 48 h at the edge of the infarct area in treatment group,and the expression level at different time points was higher than control group and the sham operation group(P<0.05).Conclusion: LLLI treatment could increase the miR-21 expression in core and edge of infarct area, and has better myocardial protection function.

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.03.012

#通信作者，男，1962年8月生，博士，教授，主任醫師，研究方向：心血管疾病的基礎與臨床，E-mail：mcatsqsdfive@163.com

中圖分類號R654.2

*國家自然科學基金資助項目81241003；河南省衛生科技創新型人才工程衛生科技領軍人才資助項目；河南省教育廳科學技術研究重點項

目資助計劃資助項目12A320026；河南省科技創新杰出人才計劃資助項目104200510007；鄭州市科技創新人才培育計劃領軍人才資助項目

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