人造堿基與人工合成生命*

陳??非???董夢醒，2???葛??猛???劉國成 中國科學院北京基因組研究所，中國科學院基因組學與信息重點實驗室 北京 0002 中國科學院大學 北京 00049

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人造堿基與人工合成生命*

陳??非1董夢醒1，2葛??猛1劉國成1
1 中國科學院北京基因組研究所，中國科學院基因組學與信息重點實驗室 北京 100101
2 中國科學院大學 北京 100049

摘要文章就人造堿基及相關人工合成生命領域內的代表性研究成果進行了全景式綜述，著重介紹了氫鍵互補及疏水性兩種最為主要的人造堿基對，探討了具有里程碑意義的六核酸分子人工合成生命及其對合成生物學未來發展的影響，簡單綜述了人造堿基在DNA檢測診斷試劑盒等方面的成功應用實例。最后對這一研究領域的前景和面臨的挑戰進行了展望。

關鍵詞人造堿基，人工擴展堿基字母，非天然堿基對，合成生物學，人工合成生命

DOI 10.16418/j.issn.1000-3045.2016.04.011

*資助項目：國家自然科學基金面上項目（31270846、21472182），中科院“百人計劃”（Y3CAS81554）

修改稿收到日期：2016年3 月9日

2014年5月，Nature 雜志報道了一項合成生物學的重大突破[1]。來自美國斯克利普斯研究所（The Scripps Research Institute）的 Floyd E. Romesberg 研究小組成功構建了包含一對人造堿基對的六核酸分子人工合成細菌，首次成功實現人造堿基對的體內復制。這一里程碑式的成果標志著人造堿基的研究工作正式從體外步入了體內。人造堿基不僅在結構上模擬天然堿基的特征，還從實際功能出發來進行設計和優化，其應用前景之廣闊給人以無限遐想。

新堿基的引入可以豐富有限的 DNA、RNA 組成元件，利用工程菌及合成生物學技術合成自然界沒有而又不易人工合成的抗生素、疫苗及其他產品。如在活疫苗開發領域，人們可以將含有人造堿基的人工合成細菌/病毒作為活疫苗接種，一方面這可以誘發免疫反應而產生疫苗作用；另一方面，因為人體內缺乏相應的人工堿基原料，所以該細菌/病毒不會在體內復制。因此，相比于天然細菌/病毒疫苗，含有人造堿基的人工合成細菌/病毒疫苗可能更為安全。對于目前還處于起始階段的 DNA 計算機而言，在原有的 ATCG 的 4 字母堿基基礎上新增加 2 個字母，就可以使 DNA 計算機從 4 進制升為 6 進制，其存儲能力和運算能力都將得到極大提升，無疑會極大地促進此項技術的發展。

盡管上述設想距離最終實現還有很長的路要走，但六核酸分子人工合成細菌的成功實現無疑是“人工合成生命”領域的一次有益的嘗試；其也會對化學合成生物學研究領域的發展起到極大的推動促進作用，并可能為合成生物學開辟出一條新的、更安全的別樣健康發展之路；無疑也將對生物安全領域產生極為深遠的影響。

1　人造堿基與合成生物學

人造堿基的研究發展至今已有近 30 年的歷史，它又被稱為非天然堿基對或人工擴展堿基字母，是一種通過對堿基的改造，人工設計合成的可以行使或模擬天然核酸功能、而又具有相對獨立性的人造 DNA。它的研究屬于合成生物學的一個重要分支——化學合成生物學的研究范疇[2]。化學合成生物學（Chemical Synthetic biology）是用以設計、描述并合成自然界不存在的具有新型化學結構的功能生物大分子元件（如新型結構的核酸、氨基酸、小泡結構等）[3]。正如 Kool[2]在 2000 年美國化學會年會上闡述的那樣，化學合成生物學關注的焦點并非在基因水平，而是非天然存在的功能性有機分子的化學結構，所以化學合成生物學又可以稱為“Bottom-up Synthetic Biology”[4]。

化學合成生物大分子部件除了具有合成生物學生物部件模塊化、標準化的特性外，其較強的獨立性（即正交性）和可操控性是其與 Venter JC 類合成生命相比的最大優勢所在[4,5]。由于 Venter JC 類合成生命并非從頭合成生命系統，其最小調節模塊是建立在基因水平上的，而在分子水平采用的仍是天然的生物大分子元件（核酸、氨基酸等），所以此類“非從頭合成生命”的生物安全問題一直為人們所擔憂[6,7]。與之相反，化學合成生物大分子元件由于在自然界中并不存在，完全獨立（正交）于天然生物實體，所以由此類生物元件所組成的“從頭合成生命系統（Synthesis of living systems from scratch）”可能是更“純潔的”，也是更易操控的[5,8]。它們可以有效地避免與自然界中已有的生物體之間發生遺傳信息重組、轉移之類的風險所導致的污染、寄生等生物安全問題；即便它們通過非正常途徑（如實驗室泄漏）進入自然界，也會因為缺乏相關的人工養料基元（如相關的人工合成堿基、氨基酸等）而迅速死亡。基于此，歐盟生物安全觀察員 Schmidt 博士[7]將之稱為終極安全的生物學平臺。

在人造堿基近30年的研究歷史中，其研究并不僅限于人工擴展堿基相關的復制、轉錄、翻譯，它們還被廣泛擴展到核酸檢測診斷技術、核酸適配體技術、核酸納米材料等領域，下面將詳述這一領域的代表性研究成果，著重介紹最新的研究進展及人工擴展堿基字母對的成功應用實例，并對這一研究領域的前景和面臨的挑戰進行展望。

2　人造堿基對的起始及?Steven?A.?Benner?的工作

Steven A.Benner 博士是國際公認的人造堿基研究領域的創始人，他在 20 世紀 80 年代中期即開始了發展人工堿基字母對的嘗試[4,6]。在對磷酸基團和脫氧核糖的替換失敗之后[3,4]，Benner 將注意力轉到堿基對上，他發現天然堿基對之間的 Watson-Crick 互補配對遵循以下兩大原則（圖1a）：

（1）形狀互補——總是在體積較大的嘌呤堿基和體積較小的嘧啶堿基之間形成形狀互補配對。

（2）氫鍵配對——總是通過一個堿基上的氫鍵供體與另一個堿基上的氫鍵受體相互作用形成氫鍵。

基于上述兩大原則，如果將天然堿基上的氫鍵供體和氫鍵受體基團視作可以互換的元件，將它們進行重新洗牌，很容易就可以設計出多對新的人工模擬堿基對（圖 1b）。此處，嘌呤和嘧啶環也可以進行適當的改造（如 K-X, Z- P 堿基對），這又可以極大地增加人工擴展堿基的種類。圖 1b 僅列出 7 種人工擴展堿基及 4 種新的獨立于（正交于）天然堿基的堿基對，其實按照形狀（大與小）和氫鍵互補（氫鍵供體和受體）原則，還可以得到更多人造堿基對[4,7,8]。設計人造堿基對后需要運用有機化學的合成技術來創造出這些新物質，并把它們裝配到 DNA分子中。觀察其作為人造堿基的行為，主要是體外復制和轉錄特性。經過 20 多年的發展，目前，人工擴展 DNA 的生物學性能表征實驗主要應包括：含有人造堿基對雙鏈DNA 的熔點檢測、單側引物延伸實驗、六核酸分子 PCR等；以上實驗的另一重要目的是檢驗設計合成人造堿基對的正交性（相對獨立性）（圖 2）[9-11]。更進一步的驗證實驗還包括人造堿基對的體外轉錄及翻譯（圖 3）[12-14]。

圖 1 Benner 創造的人造堿基對[4, 7, 8]

圖 2 人造堿基的體外生物學性能及正交性檢驗實驗（以Z-P堿基對反應體系為例）

圖3 人工堿基字母的體外轉錄及翻譯的實現[12-14]。含X:Y人造DNA堿基對的雙鏈DNA，在RNA聚合酶的作用下，經轉錄在RNA相對應位置插入人造RNA堿基rX。此種RNA經翻譯后合成含有非天然人工合成氨基酸的蛋白質

運用上述人造堿基對設計原則及生物學性能表征手段，1989 年，Benner 研究組[12]首先成功實現了包含人造堿基對 isoG-isoC 的 DNA 的體外復制和轉錄。1990 年，他們又實現了包含另一對人造堿基對 K-X 的 DNA 的體外復制和轉錄[13]。隨后在 1992 年，利用 isoG-isoC 互補配對，借助人工合成含有反密碼子 CU（isoG）的 tRNA 的幫助，Benner 研究組進一步通過體外翻譯系統將含有 isoC 的人工擴展密碼子（isoC）AG 翻譯成一個非標準氨基酸 3-碘化酪氨酸并成功的摻入到一段小肽中[14]。

通過單側引物延伸實驗，對以上兩種人造堿基對的體外復制保真性進行檢驗時，其結果并不十分理想。從20 世紀 80 年代末開始，Benner 研究組始終致力于尋找性能更優異的人造擴展堿基。2006 年，Benner 研究組終于發現了一對比較優秀的人造堿基對 Z-P[9]。筆者非常有幸在 2005 年加入了 Benner 的研究小組，并作為主要參加人員參與了 Z-P 堿基對的大部分研發工作。

Z 和 P 采用 pyDAA-puADD 氫鍵配對方式（圖 1）能夠使 Z-P 堿基對綁定的更加緊密，形成氫鍵的穩定性要比 C:G 更強[9]。更為重要的是，基于 Watson-Crick 互補配對原則設計的 Z-P 堿基對更容易被 DNA 聚合酶所識別[15]（圖 4）。單側引物延伸及 PCR 實驗也證明了這一點，絕大多數商業化的 DNA 聚合酶都能識別 Z-P 堿基對，且保真性可高達 99.8%[10,16]。2006年至今，關于 Z-P 人造堿基對共有多篇文章發表在 PNAS, JACS, Angew Chem., Nucleic Acid Res. 等國際著名生物和化學領域的頂級期刊上，其應用被廣泛地擴展到六核酸分子適配體、多重巢式 PCR 反應、luminex 核酸檢測、分子信標檢測等研究領域[16-20]。

圖4 C-G, Z-P, isoC-isoG堿基上小溝上的非共享電子對（紅圈表示）：C-G, Z-P 堿基對各有兩對非共享電子對，容易被天然DNA聚合酶所接受；isoC-isoG只有一對非共享電子對，所以不容易被天然DNA聚合酶所接受[15]

3　疏水性人造堿基對

1997—1998年，斯坦福大學的 Kool ET 創造出來一種疏水性人造堿基對（Z-F）[21-23]。他認為氫鍵配對并非人造堿基對設計所必須，相對而言化學結構的互補、堿基的堆積和靜電排斥作用更為重要。他的研究小組正是利用這一設想，成功地創造了第一對疏水性人造堿基對 Z-F（T: A 堿基對的類似物）（圖 5a）。不過 Z-F 配對的保真性并不好，而 A: F 以及 Z:T 之間的配對卻更為高效[24]。隨后，Kool ET 研究組[4]又報道了另一對可被 Klenow DNA 聚合酶識別的 P: Φ 疏水性人造堿基對（圖 5a）。Kool ET 研究組的工作揭示了發展疏水性人工合成堿基對的可能性，從而吸引了包括 Hirao I 以及Romesberg FE 在內的一批合成生物學家開始進行疏水性人造堿基對的研究。

2006年，Hirao 等人[25]開發出了一對新的疏水性人工堿基對 Ds 和 Pa（圖 5b）。然而，很快他們就發現疏水性人造堿基普遍存在自身配對的問題。偶然地，一次實驗上的疏忽讓 Hirao 等人在合成 dDsTP 時意外合成了一種衍生物 γ-氨基 dDsTP（dDsTPNH2）。出于好奇，他們使用這一衍生物代替 dDsTP 進行了單側引物延伸實驗，結果發現在這種情況下，Ds 只會摻入到與模板鏈上Pa 相對應的位置而不再摻入到與 Ds 相對應的位置。基于上述結果，2006 年該研究組報道了包含 Ds-Pa 的人工擴展 DNA 的高效 PCR 擴增，和包含這一堿基對及其衍生物（主要是包含各種修飾的 Pa）的人工擴展 DNA 的體外轉錄[25]。這一工作第一次真正實現了包含一對非天然堿基對的人工擴展 DNA 的高效體外復制和轉錄[26]。

2009年，Romesberg 團隊[7]從他們此前開發出的 60 種疏水性人工堿基中，篩選出一對在體外可以高效復制的疏水性堿基對 dMMO2-dSICS（圖 5c）。然而他們遇到了和 Hirao 研究組開發 Ds-Pa 時所遇到的類似難題，即 dSICS 的自我配對問題。所不同的是，他們通過在 dSICS 的 5 位引入一個甲基，成功地克服了這一難題，創造出了新的人造堿基對 dMMO2-d5SICS（圖 5c）[26]。在此基礎上，該團隊進一步發展出了人造堿基對 dNaM-d5SICS（圖 5c）[8]。同年，Romesberg 研究組報道了包含這兩對疏水人工堿基對的 PCR 擴增以及體外轉錄[9,10]。他們在對含有單個 dNaM-d5SICS 堿基對的模板進行 PCR 擴增的基礎上，還實現了含有兩個連續或者不連續的 dNaM-d5SICS 堿基對的模板的高保真性 PCR 擴增（99.5%—99.6% 每個循環）[11]。最近，通過對 d5SICS 堿基的進一步改造，該團隊發展出了一對更為優異的非天然堿基對 dNaM-dTPT3（圖 5c）[12]。使用 OneTaq 進行 PCR 擴增時，dNaM-dTPT3 復制的保真性超過了99.98% 每個循環，這在某種程度上已經與天然堿基的復制保真性（10-4—10-7的錯誤率）相當接近了[8]。

圖5 一些代表性的疏水性人造堿基對

4　含有人工堿基對的六核酸分子合成生命系統的誕生

至 2012 年前后，至少已經有包括 Benner、Hirao、Romesberg 3 個研究團隊獨立開發出了數對各方面性能都接近于天然堿基對的人造堿基對。這些工作為非天然堿基對的研究工作從體外走向體內，使用人造堿基對創造半合成生命奠定了堅實的基礎。

2014年，Romesberg 團隊首先在這一領域獲得了突破性的進展，他們在實現了 dNaM-d5SICS 的人造堿基對的高效高保真體外 PCR 復制和轉錄之后，隨即啟動了將這一人工堿基對應用于大腸桿菌體內的研究計劃。盡管在體外表現優異，但要將其成功的應用到生物體內顯然還必須面對更多的挑戰。首先，dNaM 和 d5SICS 完全是由人工創造出來的非天然堿基，因而 Romesberg 團隊面臨的第一個難題是如何保證細胞內有足夠的 dNaMTP 以及 d5SICSTP 單體以用于這種人工 DNA 的復制。為了解決這一問題，Romesberg FE 研究組嘗試了一系列不同來源的核苷三磷酸轉運蛋白，最終發現一種海藻葉綠體的核苷三磷酸轉運蛋白 PtNTT2 能夠高效地將添加在培養基中的 dNaMTP 和 d5SICSTP 單體運輸到細胞質中[1]。隨后，通過向培養基中添加磷酸鉀，該團隊又有效緩解了這兩種人工合成核苷三磷酸在培養基以及細胞內容易降解的問題[1]。

此后，該團隊構建了一個含有一對人工堿基對的質粒 pINF，并且系統地研究了這個質粒在大腸桿菌中的復制情況[1]。研究發現，在開啟轉運蛋白 PtNTT2 表達以及培養基中添加相應的外源人工核苷三磷酸的情況下，這一半合成質粒能夠以適當的速度和準確度進行復制，并且幾乎不阻礙大腸桿菌細胞生長，也沒有明顯表現出其他失去非天然堿基對的跡象[1]。研究結果顯示，這一半合成質粒中的非天然堿基對的復制保真性超過了 99.4%，這一保真性與某些病毒的 DNA 聚合酶相當。新堿基至少復制了 24 輪，并維持了近一周時間。當沒有這一轉運蛋白表達或是沒有新堿基提供時，非天然堿基d5SICS 和 dNaM 將會逐漸被天然堿基 A、T、C、G 所替換，并最終從基因組中完全消失。而這種堿基替換已被證明源于 DNA 復制中的堿基錯配而不是細胞內的 DNA 修復系統（圖 6）[1]。

2014年5月7日，Romesberg 領導的研究團隊在Nature 上在線優先發表論文，宣告了包含一對人造堿基對（dNaM-d5SICS）的六核酸分子半合成大腸桿菌的誕生。同期 Nature 為這一工作配發了評論[17]，5月9日出版的 Science 也對這一工作作出了評論[19]。這一工作可以說是迄今為止人造堿基研究領域最為重要的“里程碑”之一，從而標志著有關人造堿基對的研究工作正式從體外步入了體內。Romesberg 的成功激發了人們的無限遐想：有沒有可能添加更多的堿基呢？能不能用這些新零件創造出更復雜的生物呢？正如羅斯·泰爾在 Nature 的評論中所闡述的，“他們揭示了遺傳學的一種新機制，使得誕生更加豐富的生物形態成為可能，并有可能創造更加美好的生物學未來”。 Romesberg 甚至想得更遠，他認為雖然此次研究中的人工堿基對還不能參與制造新型蛋白質，但從理論上說，新增加兩個字母， DNA 就有望從 4 進制升格為 6 進制，6 種堿基意味著更多的排列組合，更龐大的氨基酸編碼庫，即可將構成蛋白質的氨基酸從目前的 20 種提升至 172 種。

圖 6 非天然堿基對模擬天然堿基對在生物體內發生作用的示意圖[1]。綠色表示在大腸桿菌中誘導表達的核苷三磷酸轉運蛋白 PtNTT2，其能夠將添加在培養基中的dNaMTP 和 d5SICSTP 單體運輸到細胞質中；紅色表示 dNaM : d5SICS 堿基對；XAA 和 YTT 分別表示對應的 tRNA 上的反密碼子和 mRNA 上的密碼子，其中 X 和 Y 代表非天然堿基，A 和T 代表天然堿基

5　人造堿基對在生命健康等領域的應用

人造堿基對的應用不僅僅限于從頭合成生命，其應用還被擴展到了核酸檢測診斷技術、六分子核酸適配體技術等領域，其在分支 DNA 檢測（branched DNA assay）診斷試劑盒中的應用是一個的典型范例。此診斷試劑盒目前已在多個國家上市，被廣泛應用于對 HIV、HPV 和 HCV 的臨床檢測診斷，僅在美國，每年就有 400 000 人應用這一診斷試劑盒，年產值超過 1 億美元。

分支 DNA 檢測技術產生得很早，依據核酸雜交原理對目標基因 DNA 或 RNA 進行檢測。該系統主要由目標檢測系統（包括 Target probe 和 capture probe 等）、branched DNA 信號放大系統（包括 label probe、preamplifier 和 amplifier）組成（圖 7a）[21,22]。Benner 等人成功地將第一對人造堿基對（isoG 和 isoC）應用此技術（又被稱為三代 branched DNA 檢測技術），他們向上述各種探針中摻入大約 30% 的非天然堿基 isoC 和 isoG，改善了由于多種不同的探針在同一體系中使用所產生的背景噪音信號從而使檢測靈敏度從 100 000 個 HIV 分子/毫升升至 1 000 個HIV 分子/毫升[20,23,27]。

人造堿基對在分子信標（molecular beacon）核酸檢測技術中的應用也被廣泛嘗試。2008 年，Benner 研究組報道了一種新型的分子信標（圖 7b）[28]。在這種分子信標中，非天然堿基對 Z-P 被引入到分子信標的莖部。由于 Z-P 堿基對與天然堿基對之間存在正交性，使得各種非特異性結合明顯減少，從而顯著地提高了分子信標的檢測靈敏度[28]。2010 年 Benner 研究組還將 Z-P 堿基對引入到反向巢式 PCR 的引物中，同樣取得了非常理想地提高靈敏度的效果（圖 7c）[29]。

科學家們也嘗試將人工擴展堿基應用于核酸適配體（aptamer）研究領域。2013 年，Hirao 研究組首次將非天然堿基引入到了 aptamer 篩選中（圖 7d）[30]。2014 年，Benner 研究組首次將完全隨機的人工擴展DNA 文庫成功用于 aptamer 篩選（圖 7e）[31]。結果證明，相對于傳統 aptamer 動輒 15—20 輪次的篩選工作量而言，采用人工擴展 DNA 文庫進行篩選的輪次和工作量大大降低，篩選得到的 aptamer 性能也更好[30,31]。

對于人造堿基的應用研究，除了上述提到的基于正交性和多樣性所產生的各種應用之外，科學家的一些偶然發現也促成了一些新的應用。比如 Hirao 研究組在優化各種非天然堿基對時，發現一種 Ds 堿基的衍生物 Dss 可以發出強烈的熒光，這種堿基同樣可以與 Pn 或者 Px 形成穩定配對，更為重要的是，一旦配對形成，Dss 堿基所發出的熒光會被完全淬滅[32]。基于這一發現，Hirao I 研究組成功開發了利用這一新型堿基對作為熒光和淬滅基團的分子信標（圖 7f），并將這一堿基對成功地用在了實時定量 PCR 中（圖 7g）[32]。

6　總結和展望

除了人工改造堿基之外，科學家們也一直在進行氨基酸的人工改造。以斯克利普斯研究所 Peter Schultz 為代表的一些合成生物學家已實現了向蛋白質中定點摻入各種非天然氨基酸以實現各種功能，不過他們是利用天然堿基的無義密碼子 TAG 來進行編碼的，因而一次只能摻入一種非天然氨基酸。要想同時向蛋白質中摻入多種不同的非天然氨基酸，必然需要對現有的遺傳信息系統進行人工擴展。從 Benner[2]率先提出并開展有關人造堿基對的研究工作以來，已經過去了 20 多年，一系列性能優越的人造堿基對被不同的研究團隊創造出來。2014 年含有非天然堿基對的半合成生命的誕生更是標志著這一領域的研究正式從體外走向了體內[1,17,19]。然而要想真正實現在生物體內使用人造堿基對，利用人工擴展密碼子編碼各種非天然氨基酸，從而按需定制各種非天然功能蛋白質的長遠目標，這一領域還有很長的路要走。

首先，需要設計并創造性能更為優越的人造堿基對。必須承認即便是現在最為成功的人造堿基對的復制保真性較天然堿基對而言也仍然存在著明顯的差距。其次，需要進一步優化與轉錄、翻譯相關的各種酶及工作元件。盡管在 20 多年前，Bernner 研究組就已經利用早期人造堿基對 isoC-isoG 在體外實現了從復制到轉錄、再到翻譯的中心法則整個流程。但在那之后，相對于復制，有關人造堿基對的轉錄尤其是翻譯的研究工作就大大滯后了。

總而言之，Romesberg 的成功使得合成生物學家們的目標更加明晰——就是在生物體內擴展遺傳密碼，提高遺傳密碼的多樣性，進而可以根據需要定制出各種含有人工擴展堿基的功能 DNA、RNA 及含有各種非天然氨基酸的功能蛋白質的新型生命形式。當然，這項技術和任何技術一樣（如基因工程、核物理等），既可以造福人類，也可以毀滅人類（生物武器、核武器）。技術本身并沒有問題，關鍵是看應用技術的人的動機。希望在未來科學家可以創造出更多形式和功能的可控新型生命，造福全人類。

圖 7 一些人工擴展堿基的應用實例

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陳??非 中科院北京基因組所研究員，博士生導師，中科院“百人計劃”引進人才。在美期間曾師從“合成生物學”聯合創始人 Steven A. Benner。目前主要致力于致病微生物基因組學及宏基因組學研究，有多篇研究論文發表在 PNAS、JACS、Nucleic Acid Res 等國際頂級期刊上。E-mail: chenfei@big.ac.cn

Chen Fei Professor in “100 Talents Program” of Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences. From 2005 to 2012, he worked in Benner SA’s group, one of the pioneer groups in the emerging field of “Artificially DNA bases”. Currently, his research interest is mainly focused on pathogen genomics, as well as metagenomics. He has published number of peer-reviewed papers in scientific journals including PNAS, JACS, and Nucleic Acid Res.. E-mail: chenfei@big.ac.cn

Artificial Base and Synthetic Life

Chen Fei1Dong Mengxing1,2Ge Meng1Liu Guocheng1
（1 CAS Key Laboratory of Genome Sciences and Information, Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China; 2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China）

Abstract“Artificial Base” is also known as “Expanded Genetic Alphabets”. Through modifying normal bases, it is designed to achieve the function of native nucleic acid, which was first introduced about thirty years ago. In 2014, Nature reported a semi-synthetic Escherichia coli, whose genome contains a pair of unnatural base pair which can be stably propagated in the semi-synthetic bacterium. This landmark work was selected as one of the top ten breakthroughs of 2014 by the Science journal. Here, we panoramically review the representative achievements in the field of artificial base and synthetic life, particularly two leading artificial base pairs respectively with alternative hydrogen bonding pattern and hydrophobic shape complementation pattern. Moreover, we discuss the significant work regarding the synthetic living system with sixletter nucleotides and its effect on future developments of synthetic biology. The successful applications of diagnostic kit for DNA test and other cases are also introduced. Finally, we discuss the further work required to this field and the challenges.

Keywordsartificial base， expanded genetic alphabets, unnatural base pair, synthetic biology, synthetic life