擬南芥bso-1突變體的基因定位及表型分析

夏群芳，周樹敏，王偉倩，李瑞沙，張紅莉，張　衛

(上海大學 生命科學學院，上海市能源作物重點實驗室，上海 200444)

擬南芥bso-1突變體的基因定位及表型分析

夏群芳，周樹敏，王偉倩，李瑞沙，張紅莉，張衛*

(上海大學 生命科學學院，上海市能源作物重點實驗室，上海 200444)

摘要:通過EMS化學誘變在擬南芥Columbia(Col-0)野生型突變體庫中篩選獲得1株器官顯著增大的突變體，命名為big size organ1(bso-1)。遺傳分析表明，bso-1受單個隱性核基因控制。表型觀察發現，突變體植株的幼苗、花、果莢及種子與野生型相比都表現出明顯的增大。組織切片結果顯示，突變體種子的增大主要由胚細胞個體增大導致胚體積增大而實現，因此突變體種子的重量也較野生型有明顯增加。利用圖位克隆方法將相關基因初步定位在4號染色體上SSLP標記T5L19與F28M11之間58kb區間內，生物信息學分析顯示此區間內未見調控植物器官大小發育相關的已知基因的報道。該研究結果為進一步克隆bso-1突變體相關基因及探討其在控制植物器官發育尤其是種子發育過程中的作用奠定了基礎。

關鍵詞:擬南芥；種子；器官；基因定位

器官大小是植物的一個重要形態特征，它具有嚴格的種屬特異性，在同等條件下同種生態型植株器官大小差異基本可以忽略。器官大小受外界因素如光照、營養等的影響較小，主要由其內在生物學機制進行調控。器官發育需要經歷細胞分裂、細胞分化及細胞生長等一系列復雜的生物學過程，其中細胞分裂和細胞擴張是影響器官最終大小的重要因素。擬南芥(Arabidopsisthaliana)器官大小相關調控基因可通過不同途徑調控細胞分裂及生長：轉錄調控途徑，如JAGGED編碼一個鋅指蛋白，通過延遲或激活細胞周期，影響細胞分裂，從而改變器官大小[1]；激素(生長素、赤霉素、油菜素內酯、細胞分裂素等)調節途徑；細胞壁松弛等途徑[2]。

種子不僅在植物環境適應方面起重要作用，在農業生產中也有重要的利用價值。研究種子大小相關的調控基因對于改良作物品質，提高作物產量具有重要理論意義和應用價值。被子植物的種子一般由胚、胚乳和種皮組成，一般情況下基因通過影響這三部分的細胞分裂和生長來調控種子的發育。例如：擬南芥中CYP78A5和ARF2過促進或抑制種皮細胞分裂從而影響種子的發育進程和最終的體積[3-6]；TTG2和AP2則通過調控種皮細胞的伸長來改變種子大小[7-8]；EOD3/CYP78A6可同時影響細胞分裂和細胞伸長來調控種皮表面積大小，進而影響種子的大小[9]；SHB1通過增強胚乳細胞分裂，促進種子生長[10]。然而，迄今為止對于植物中調控和決定器官大小的相關分子機制的了解還十分有限。

本實驗通過對EMS化學誘變的擬南芥突變體庫進行篩選，獲得了1株器官體積顯著增大的突變體，根據其表型，暫命名為bso-1(bigsizeorgan1)。本研究主要對bso-1突變體進行了相關基因的定位和表型觀察，以期為后續BSO-1基因克隆及功能分析積累實驗數據。

1材料和方法

1.1植物材料種植

擬南芥Columbia(Col)生態型和bso-1突變體種子點種到培養介質(黑土∶蛭石=1∶3)中，覆蓋1層保鮮膜，4 ℃春化3～4 d后，移至光照培養間培養，培養條件為：溫度23 ℃，濕度：60%～70%，光照強度：50 μE·m-2·s-1,16 h光照/8 h黑暗，待種子萌發長出2片真葉時揭去薄膜[11]。

1.2植株形態學觀察及表型統計

選取Col與bso-1同一時期的蓮座葉，在Leica DM750生物顯微鏡下(6×8倍放大)觀察葉刺形狀變化并統計葉片表面表皮毛數量。

1.3花粉母細胞核型分析

收集5～6期花藥，在載玻片上輕輕擠壓出花粉母細胞，利用DAPI染液對花粉母細胞進行染色，封片后在Leica DM2500熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.4bso-1突變體遺傳分析

以bso-1突變體為母本，Col野生型為父本，回交得到F1代植株，觀察表型；F1代植物自交得到的F2代植株，用于表型觀察和統計分析。

1.5石蠟切片

將成熟種子浸泡在50% FAA中常溫過夜；取出種子，置于50%酒精30 min，洗去固定液；50%～100%梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋。用旋轉式切片機做連續切片，切片厚度5 μm。切片用二甲苯脫蠟，梯度酒精復水，1%甲苯胺藍染色，中性樹膠封片。在Leica DM2500光學顯微鏡下觀察并拍照[12]。

1.6基因圖位克隆

突變體與Ler野生型雜交所得的F1代植株通過自交獲取F2代植物。選取F2代植物中具有突變體表型的植株用于基因定位分析。基因圖位克隆步驟參照張衛等的方法[13]。所需分子標記參考網站(http://amp.genomics.org.cn)上的相關信息。

2結果與分析

2.1bso-1 形態觀察及分析

通過對bso-1突變體和野生型擬南芥植物的形態學比較發現：突變體bso-1的幼苗較野生型植株有所增大(圖1，A、B)，而且花萼、花瓣相比野生型有顯著的增大(圖1，D、H)，果莢在長度和寬度上都超過了野生型(圖1，E)。此外，突變體植株葉形比野生型顯得更圓，葉柄也更明顯(圖1，F、G)，而且對比相同生長發育時期的植株形態，突變體植株也較野生型顯著增高(圖1，C)，同時表現出明顯的晚花特征(圖1，I、J)。以上結果說明，與野生型植株相比，突變體bso-1植株在多種器官上都存在不同程度的增大效應。

2.2bso-1突變體體細胞染色體數目鑒定

器官體積增大是多倍體植株最為顯著的特征，主要表現在葉片、花、果實及種子等的形態特征上[14]。為了鑒別bso-1突變體器官增大的表型是否為多倍體的特征表現，我們通過DAPI染色，對突變體花粉母細胞染色體數目進行檢測，發現其中的染色體數目正常，為5對(圖2箭頭所示)，這表明bso-1突變體器官增大的表型變化并不是由染色體多倍體化所導致的。

A、F.野生型幼苗；B、G.突變體幼苗；C.野生型與突變體植株大小比較(均為抽苔后開出第15朵花時的植株)；D.野生型與突變體花器官的比較；E.野生型與突變體果莢的比較；H.野生型與突變體萼片的比較； I.野生型和突變體植株開花時間的統計比較(n≥15, P<0.05)；J.野生型與突變體開花早晚的比較(同為12～14片蓮座葉時的植株照片)圖1　擬南芥突變體bso-1表型觀察A,F. Seedling of wild type； B,G. Seedling of bso-1; bso-1 plant(C), flower organ(D), silique(E) and sepal(H), and flower time(I and J) compared with wild type (n≥15, P<0.05)Fig.1　Phenotype analyses of bso-1

通過DAPI染色法對花粉母細胞中染色體數目進行觀察，箭頭所示部位為染色體圖2　突變體bso-1染色體檢測DAPI assay of chromosome numbers in microsporocyte. Arrows indicate chromosomesFig.2　The chromosome number detection of bso-1

2.3bso-1突變體表皮毛的觀察及分析

擬南芥的表皮毛是一種特化的、典型的單細胞表皮毛，沒有腺體，一般有3個分支[15]。將葉片置于光學顯微鏡下觀察發現bso-1突變體單位面積表皮毛數量較野生型植株有一定程度的增多(圖3，A、E)，野生型植株葉片表皮毛多為3個分支(圖3，B、F)，而bso-1突變體表皮毛分支數量增加至4個以上(圖3，C、D和F)。這些結果預示著bso-1突變體的相關突變基因與植株表皮毛生長發育也具有一定的相關性。

2.4bso-1遺傳分析

以bso-1突變體為母本，Col野生型為父本進行回交得到F1代種子，F1代植株均為野生型表型，說明該突變體受隱性基因調控。F1代植株通過自交所得的F2代植物中出現表型性狀的分離，即突變體表型(102株)與野生型表型(313株)比例約為1∶3，符合孟德爾遺傳定理。因此，可以初步確定突變體表型受單個隱性核基因控制。

2.5bso-1突變體種子的觀察與分析

bso-1突變體與野生型相比較最明顯也是最有價值的表征是其種子的大小比野生型植物(不論是Col型還是Ler型)有明顯的增長(圖4，A)。對種子重量的統計發現，bso-1突變體種子重量幾乎是野生型的1倍(圖4，B)。剝出種子的胚進行比較，發現bso-1種子胚的體積遠大于野生型種子的胚(圖4，C、D)。通過石蠟切片對比觀察野生型與bso-1突變體的胚細胞的數量和大小，結果顯示兩者種子胚細胞的大小相當，但是突變體種子胚中細胞的數量顯著增多(圖4，E、F)，同時對種皮細胞的大小作比較顯示細胞的大小并無顯著差異(圖4，G、H)。以上結果預示bso-1種子變大跟其內部胚體積增大相關，且bso-1突變體相關基因可能通過調控細胞分裂增長來影響種子胚的大小，從而決定種子體積。

A.野生型與突變體葉片表皮毛密度的比較；B. 野生型表皮毛典型的3個分叉；C. 突變體4個分叉的表皮毛； D. 突變體中5個分叉的表皮毛；E.葉片單位面積上表皮毛數量的統計結果；F. 野生型和突變體中不同分叉形式的表皮毛的比率。統計數據來源于3組獨立實驗，每個數據至少取樣10個植株，每株取第3、4、5片真葉進行統計(P<0.05)圖3　野生型與bso-1突變體葉片表皮毛數量及形態的分析A. The density of trichomes in bso-1 compared with wild type; B. The typical trichome in wild type; C. Four branchy trichome in bso-1; D. Five branchy trichome in bso-1; E. Trichome number statistics in per unit area; F. The ratio of different trichome numbers in bso-1 and wild type. The statistical data come from three independent experiments, at least 10 plants had been used for per data. The materials come from and the third, fourth and fifth true leaf(P<0.05).Fig.3　The chromosome number detection of bso-1

A.野生型與突變體種子大小的比較；B.野生型與突變體種子重量的比較(100粒種子的平均重量，每組數值重復5次)；C、D. 野生型與突變體種子胚大小的比較；E、F. 野生型與突變體種子的石蠟切片；G、H.野生型與突變體種皮細胞的比較圖4　野生型與突變體種子的比較Comparison of bso-1 and wild type seed size (A) and average seed weight (B) (milligrams per 100 seeds, Standard deviations are shown, n=5);Embryo size in wild type (C) and bso-1(D); Paraffin sections of seed showing embryo and seed coat in wild type (E, G) and bso-1(F, H).Fig.4　Comparison of bso-1 and wild type seeds

2.6bso-1突變體相關基因的定位

遺傳分析顯示bso-1突變體由一個隱性基因控制，因此通過圖位克隆方法對bso-1的突變基因進行了定位。利用網站(http://amp.genomics.org.cn)上發布的信息，選擇在擬南芥Col生態型和Ler生態型之間存在多態性的區段為分子標記設計引物。首先選用在擬南芥基因組中均勻分布的20個分子標記(表1)進行粗定位，結果顯示，突變位點與4號染色體上的SSLP分子標記F28A11連鎖(圖5，A)。進一步在4號染色體上設計新的分子標記(表1)對突變基因進行精細定位，部分定位結果如圖5，B所示，利用分子標記F1K3和FCA2在23個樣本中均只鑒定出2個重組子，且2個分子標記鑒定出的重組子并不在同一樣本中(F1K3鑒定結果顯示4、13號樣本為重組子，而FCA2鑒定結果顯示8、17號樣本為重組子)，這說明這2個分子標記位于突變位點兩側。進一步在上述兩分子標記之間的區域內選擇分子標記進行定位。最終將bso-1的突變位點定位在4號染色體上T5L19與F28M11之間58kb區間內(圖5，A)。通過生物信息學數據的分析(http://www.arabidopsis.org)顯示此區間內含有約50個候選基因，但未見有與植物器官發育調控相關基因的報道。

表1　分子標記引物表

A.bso-1突變基因在4號染色體上的定位區域示意圖；B. 部分基因定位結果(以F1K3和FCA2分子標記為例)：L.Ler； C.Col ； 1～23 表示1～23號樣本；*表示出現重組子的樣本。圖5　bso-1突變體基因定位示意圖A. Gene mapping of bos-1 on 4 chromosome; B. The part results of PCR analysis for mapping：L indicates Ler, C indicates Col，Line 1-23 indicate 23 different samples； * means the recombinant in a sample.Fig. 5　Genetic mapping of bso-1

3討論

植物種子和器官大小是重要的生物性狀，也是植物健康生長的重要指標，器官大小的調控一直以來都是發育生物學領域的研究熱點之一。已知許多母系遺傳因子如TTG2、AP2、ARF2、CYP78A5/KLUH、CYP78A6/EOD3、DA1和DA2等都能影響植物器官和種子的大小[3,4,7-9,16]。最新研究證明擬南芥中泛素受體DA1通過直接與去泛素化酶SOD2互作，介導SOD2的降解，從而調控擬南芥種子和器官的發育，最終影響其體積大小[16]。然而，對于植物中決定其種子及器官大小的詳細分子機理還需不斷地深入研究。本實驗室獲得的突變體bso-1，通過可見表型觀察發現其不但具有較大的花、果莢、種子，而且植株也較野生型更高大，并表現出明顯的晚花特征。雖然，植物中器官體積增大是多倍體植株的典型特征之一，但通過DAPI染色鑒定顯示bso-1染色體數目正常，這意味著bso-1突變體中器官體積的增大并不是多倍體效應所致。因此作為單基因隱性突變體的bso-1，其器官增大特性的廣泛表現也意味著此基因對于植物生長發育調控起著至關重要的作用，對此基因的克隆顯得十分必要。

擬南芥表皮毛的形成主要分為以下過程：表皮毛發生及排布、核內復制、分支形成、分支生長方向的確定。相比野生型植株，bso-1突變體表皮毛分支的生長方向發生變化，分支增加至4個以上。已有研究發現在表皮毛形態建成中微絲微管具有重要作用，其中微絲參與表皮毛突起形成的發生和排布，微管則與突起延長有關。因此bso-1突變體基因是否參與調控微管的形成，從而改變表皮毛突起延長的方向，最終影響表皮毛分支生長方向，導致分支增加[17]，這也將是后續對bso-1基因功能研究有待解答的問題。將Col與bso-1種子的胚進行比較，發現bso-1種子的胚明顯增大。石蠟切片觀察顯示突變體種子增大主要是胚細胞增多導致，這也預示著bso-1突變體相關基因與細胞分裂可能存在密切聯系。此外，種子的生長需要胚、胚乳及種皮共同協調作用，突變體種子變大，除胚明顯變大外，也有賴于種皮的生長，以避免種皮對胚生長的抑制，所以我們推測bso-1突變體相關基因還能夠控制珠被細胞分裂或伸長來影響種皮生長，最終影響種子大小。

通過圖位克隆bso-1突變體相關基因被大致定位在4號染色體上SSLP標記T5L19與F28M11之間58kb區間內，生物信息學分析顯示此區間內未見調控植物器官大小發育相關已知基因的報道。因此，后續還需進一步實現基因的克隆和功能分析，以闡述bso-1突變體相關基因是通過何種途徑調控種子和器官最終大小的分子機理。

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(編輯:宋亞珍)

Gene Mapping and Phenotype Analyses of anArabidopsisMutantbigsizeorgan1

XIA Qunfang, ZHOU Shumin, WANG Weiqian, LI Ruisha, ZHANG Hongli, ZHANG Wei*

(School of Life Science, Shanghai Key Laboratory of Bio-energy Crops, Shanghai University, Shanghai 200444, China)

Abstract:An abnormal organs mutant big size organ-1 (bso-1), was isolated by enthyl-methane sulfonate (EMS) mutagenesis strategy. Genetic analysis indicated that the mutation phenotype was controlled by one recessive nuclear gene. Compared to the wild-type, bso-1 showed significant increase in seedling, flowers, pods and seeds. The detection in paraffin sections of seeds displayed that the increase of the bso-1 seeds primarily due to the increase of germ cell, so the seeds of bso-1 is heavier than that of wild type. The mutation loci was mapped to the region of 58kb between SSLP marker T5L19 and F28M11 on Chr.4. According to the result of bio-informatics analysis, there are no previous genes about organ development in the region. The results provide a basis for further cloning and functional analysis of bso-1 in organ development, especially in seed development.

Key words:Arabidopsis; seed; organ; gene mapping

文章編號:1000-4025(2016)04-0641-07

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.04.0641

收稿日期:2015-12-14;修改稿收到日期:2016-03-18

基金項目:上海市自然科學基金(15ZR1416700)；國家自然科學基金(30870225)；上海市浦江計劃項目(08PJ1405500)

作者簡介:夏群芳(1990-)， 女，在讀碩士研究生， 主要從事擬南芥溫敏雄性不育的研究。E-mail:roubaoxia@163.com *通信作者:張衛，博士，教授，主要從事擬南芥育性研究。E-mail:zhw62207@shu.edu.cn

中圖分類號:Q944.2;Q343.1+7

文獻標志碼:A