百脈根Rac1蛋白多克隆抗體的制備與應用

柯丹霞，張　偉，李祥永，楊明影，于小瑞，朱涵雪，王曉菲

百脈根Rac1蛋白多克隆抗體的制備與應用

柯丹霞，張偉，李祥永，楊明影，于小瑞，朱涵雪，王曉菲

(信陽師范學院 生命科學學院，大別山農業生物資源保護與利用研究院，河南信陽 464000)

摘要:Rop基因在豆科植物與根瘤菌共生互作過程中發揮重要作用。該研究以模式豆科植物百脈根根系cDNA為模板，擴增得到百脈根的1個Rop基因(Rac1)，將其連接到原核表達載體pET28a，轉化獲得Rac1基因的大腸桿菌BL21(DE3)工程菌。優化Rac1蛋白誘導表達條件，親和吸附法純化蛋白，制備Rac1多克隆抗體，并應用該抗體檢測Rac1過表達轉基因植株中Rac1蛋白的表達水平。結果顯示：(1)經雙酶切和測序鑒定，成功構建pET28a-Rac1原核表達載體。(2)Rac1蛋白的最佳誘導表達條件為：IPTG濃度0.1 mmol/L、溫度20 ℃、時間6 h，重組蛋白以可溶形式高效表達；純化的Rac1蛋白經SDS-PAGE檢測，目的條帶大小為25 kD左右，且條帶清晰、單一無雜帶。(3)Western blotting顯示，制備的多克隆抗體能特異識別其對應的抗原，且效價較高。(4)通過農桿菌介導的毛根轉化法獲得Rac1過表達植株的陽性毛根，提取陽性毛根總蛋白，Western blotting分析顯示過表達植株中Rac1蛋白表達量顯著高于空載體對照，從翻譯水平證實過表達載體構建的有效性。該研究制備的Rac1多克隆抗體能夠高效特異地檢測來源于百脈根體內的Rac1蛋白，這將為進一步開展Rac1在共生信號轉導途徑中的生物學功能研究提供有利工具。

關鍵詞:百脈根；Rac1；原核表達；多克隆抗體

Rop蛋白通過與各種調控因子的相互作用參與植物體內多種生命活動，包括調控細胞的極性生長、發育與形態建成、內膜運輸等過程[1-5]。……