提高番茄品質的番茄去泛素化酶基因AMSH3

劉艷紅,李光偉,劉永勝

(合肥工業大學 生物與食品工程學院,安徽 合肥　230009)

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提高番茄品質的番茄去泛素化酶基因AMSH3

劉艷紅,李光偉,劉永勝

(合肥工業大學 生物與食品工程學院,安徽 合肥230009)

摘要:AMSH3酶是去泛素化酶中MPN(+)/JAMM 蛋白酶家族的一員,能結合泛素化蛋白上的泛素分子。文章在番茄中發現了一去泛素化酶基因SlAMSH3,與擬南芥去泛素化酶基因AtAMSH3在核酸水平和蛋白水平分別有81%和71%的相似性。擬南芥中去泛素化酶AtAMSH3會影響植物液泡的形成和液泡蛋白的運輸途徑。文章構建了SlAMSH3果實特異表達的過表達載體，并通過根瘤農桿菌介導轉化到野生型番茄中,通過篩選獲得SlAMSH3在果實中高表達陽性株系,實時熒光定量聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)分析顯示,轉基因番茄果實中SlAMSH3的表達量明顯高于野生型果實(p<0.05)。文章測定了陽性番茄株系綠熟期果實葉綠素質量濃度及紅熟期果實的單果質量、果實糖度、果實硬度、番茄紅素質量濃度和β-胡蘿卜素質量濃度。結果表明,轉基因番茄果實的葉綠素總質量濃度、番茄紅素和β-胡蘿卜素比野生型分別提高178.61%、40.53%和74.86%,其他指標無顯著差異。因此，SlAMSH3果實特異過表達的方法能夠改良番茄果實品質,為基因工程方法改良番茄果實品質做出了新嘗試。

關鍵詞:AMSH3基因;果實特異過表達;遺傳轉化;轉基因番茄;果實品質改良

0引言

植物生長發育的各個階段,包括胚胎發生、種子萌發、營養生長、果實成熟和葉片衰老等都受到多種激素信號的控制[1]。雖然植物激素的分子結構比較簡單,但具有十分復雜的生理效應[2]。大量研究表明,泛素蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome pathway,UPP)在植物生長發育,包括激素合成、感知和下游信號傳導、自交不親和、抗病、表觀遺傳及植物形態建成等過程都發揮著重要作用[3]。該途徑也是一個被嚴格調控的可逆過程,其中去泛素化酶的調節是一個重要的環節。

目前研究證實,細胞內廣泛存在許多去泛素化酶(deubiquitinating enzymes,DUBs),主要分為以泛素羧基末端水解酶家族和泛素特異性加工酶家族為主的5種類型,分別為泛素羧基末端水解酶家族(ubiquitin C2 terminal hydrolases,UCHs)、泛素特異性加工酶家族(ubiquitin-specific processing enzymes,UBPs或ubiquitin- specific proteases,USPs)、卵巢腫瘤(OTU)相關蛋白酶、Ataxin-3、MPN(+)/JAMM 蛋白酶[4]。這些不同類型的去泛素化酶均能水解底物蛋白上的泛素鏈之間的鏈接,起到去泛素化的作用,對蛋白降解進行反向調節,從而影響蛋白質的功能。去泛素化酶是一類數量很大的蛋白酶家族，去泛素化酶識別泛素、底物或者蛋白酶體的特異性序列[5],主要是作用于泛素-蛋白酶體系統中已泛素化的蛋白底物,通過水解泛素羧基末端的酯鍵、肽鍵或異肽鍵,將泛素分子特異性從連接有泛素的蛋白或者前體蛋白上脫離出來,重新進入細胞內蛋白調節的循環中[6]。

AMSH3酶是去泛素化酶中MPN(+)/JAMM 蛋白酶家族的一員，是一類能結合泛素化蛋白上泛素分子的金屬蛋白酶,具有MPN序列,或稱JAMM(Jab1/MPN domain associated metalloisopeptidase)序列。這一序列含有較為保守的2個組氨酸殘基和1個天冬氨酸殘基,它們與二價鋅離子共同構成催化中心[7]。泛素和去泛素不僅對各種細胞的生理過程有重要的影響,也對細胞器的形成發揮著重要作用。在擬南芥中,AtAMSH3酶不僅能夠水解植物體外和積累在體內的K48-和K63-鏈接的2種泛素鏈,而且是苯乙烯基染料FM64和生長素調節因子PIN2進行高效細胞內吞作用所必須的。而AMSH3突變體植株不僅不能形成中央裂解大液泡和積累吞噬體,還會將液泡蛋白錯誤地運輸到細胞間隙中[8]。

成熟的番茄果實是人類攝取天然類胡蘿卜素和番茄紅素的主要來源,研究人員為了提高番茄果實品質,通過基因工程技術進行了廣泛嘗試,研究發現使用果實特異性表達啟動子TMF7比使用CaMV35S等組成型啟動子效果好很多[9-10]。

一方面,使用CaMV35S等組成型啟動子增加或降低某一關鍵基因的表達會引起許多負面效應；另一方面,TMF7啟動子由于可以控制外源基因在果實中高效表達,避免了外源基因在植物的其他組織器官中的積累,減少了對植物的不利影響[9-10]。因此通過組織、器官特異性啟動子實現對基因表達的精確調控,成為提高外源基因表達效率的有益實驗而得到廣泛應用[11]。

本文通過生物信息比對，在番茄中發現了與擬南芥AtAMSH3同源性較高的SlAMSH3,克隆了番茄SlAMSH3基因,利用植物過表達載體pBI121-TMF7,在番茄植株中過表達SlAMSH3基因,采用農桿菌介導法對野生型番茄進行遺傳轉化,并利用轉基因植株研究了SlAMSH3果實特異過表達對番茄品質的影響。

1材料與方法

番茄(Solanum lycopersicum Mill.cv.Ailsa Craig)、大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α菌株、農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105及PBI121-35S-GFP 載體和番茄表達載體pBI121-TMF7 均為本實驗室保存；Trizol購自于Invitrogen；反轉錄酶、Taq DNA 聚合酶、pEASY-Blunt載體、T4 DNA連接酶、限制性內切酶購自TaKaRa公司；質粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自TIANGEN 公司。

1.1番茄AMSH3基因的克隆

按照Sol Genomics Network中番茄SlAMSH3基因序列(登錄號Solyc01g060280.2.1)設計引物AMSH3-F1、AMSH3-R1,用于構建pBI121-TMF7-SlAMSH3載體。提取野生型番茄幼苗總RNA,通過實時熒光定量聚合鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)擴增SlAMSH3基因。PCR條件為:94℃預變性5 min;94℃30 s;57℃ 30 s;72℃ 108 s,32 個循環;72℃ 10 min。將PCR 產物與pEASY-Blunt載體連接后轉化大腸桿菌,對重組子進行PCR和酶切驗證,陽性克隆送南京金斯瑞生物技術服務有限公司測序。

1.2AMSH3果實特異過表達載體構建

參照載體pEASY-Blunt和pBI121-TM-F7的酶切位點,采用Sequencher軟件對SlAMSH3基因序列進行限制性內切酶分析,運用軟件Primer Premier 5設計帶酶切位點的特異引物,見表1所列。分別以測序正確后的SlAMSH3重組質粒和pBI121-TMF7載體做雙酶切并膠回收目的片段和載體片段,將目的片段連接到pBI121-TMF7載體上,則構建成番茄果實特異的pBI121-TMF7-SlAMSH3植物過表達載體。將得到的連接產物轉化進入大腸桿菌感受態細胞,篩選出陽性菌落,提取質粒酶切驗證。

表1　本研究所用的引物

1.3番茄的遺傳轉化及轉基因植株的鑒定

根據文獻[12-13],將重組質粒pBI121-TMF7-SlAMSH3通過液氮冷擊法導入農桿菌EHA105,在含有利福平和卡那霉素(50 mg/L)的培養基上28℃培養2 d,陽性菌用以轉化野生型番茄。番茄種子用自來水浸泡12 h,先用75%的酒精漂洗2 min,再用15%的次氯酸鈉溶液浸泡消毒15 min,用無菌水漂洗6次后播種至1/2 MS培養基。22℃,4 d左右,露白后轉至光照下培養。待子葉完全舒展開時,將子葉剪下置于預培養基(MS+1 mg/L 6-BA+0.04 mg/L IAA)上培養2 d;將帶有pBI121-TMF7-SlAMSH3載體的農桿菌28℃過夜培養,室溫下5 000 r/min離心5 min收集菌。

用稀釋后的農桿菌浸染預培養3 d的子葉10 min;吸去子葉上多余菌液后,將子葉轉到共培養基(MS+1 mg/L KT+1 mg/L 2,4-D+10 mg/L ACE)上培養2 d;然后轉到篩選培養基(MS+500 mg/L SB+2 mg/L 6-BA+50 mg/L KANA+0.2 mg/L IAA)上,22℃下光照培養(16 h 光照,8 h黑暗),每21 d更換1次培養基;待愈傷組織上長出的不定芽長至2 cm左右時,將芽切下轉移至生根培養基(MS+500 mg/L SB+2 mg/L IAA+50 mg/L KANA)上生根;移入營養土,放于溫室中栽培，提取番茄基因組DNA。以DNA為模版,pBI121-TMF7質粒為陽性對照,同時用野生型番茄DNA作為陰性對照,根據pBI121 載體篩選標記基因新霉素磷酶基因(NPTⅡ)(登錄號 AF485783)序列合成引物NPTⅡ-F 和NPTⅡ-R,對轉基因植株進行PCR 鑒定。PCR 反應條件：95℃預變性5 min;95℃變性30 s,64℃退火30 s,72℃延伸50 s,30個循環;最后72℃延伸5 min。

1.4實時熒光定量PCR

分別提取野生型和轉基因T1代果實總RNA,反轉錄合成cDNA,以此為模板進行實時熒光定量PCR。SlAMSH3基因使用的引物是AMSH3DL-F、AMSH3DL-R。以番茄UBI為內參基因(登陸號X58253),其PCR擴增引物為UBIDL-F、UBIDL-R。PCR 反應條件為:95℃預變性30 s;95℃變性5 s,60℃退火20 s,40個循環;95℃15 s,60℃延伸1 min,95℃15 s。

1.5葉綠素質量濃度的測定

葉綠素質量濃度測定按照文獻[14-16]介紹的方法,剪取番茄綠熟期果實果皮0.2～0.5 g,液氮充分研磨,用1 mL 80%的丙酮充分萃取,萃取液離心后用分光光度計檢測,讀取645 nm和663 nm下的光吸收值A645和A663。按照MacKinney常數計算葉綠素a和葉綠素b的質量濃度，其具體計算公式為:

ρ(葉綠素a)=12.7(A663)-2.69(A645),

ρ(葉綠素b)=22.9(A645)-4.48(A663)。

1.6番茄紅素和β-胡蘿卜素質量濃度的測定

番茄紅素和β-胡蘿卜素質量濃度的測定按照參考文獻[17],取同一紅熟期的番茄果實相同部位的果皮0.5～1.0 g,液氮充分研磨,加2 mL丙酮室溫下萃取10 min。再加入2 mL的二氯甲烷震蕩靜置10 min,短瞬離心后,吸取帶有顏色的上清低溫保存(整個過程要避光)。萃取的樣品使用C18色譜柱Spherisorb ODS-2 column(silica 5 mm,3.2 mm×250 mm)(Phenomenex?)進行高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)分析。每個萃取的樣品吸取20 μL上柱,流動相的組成為乙晴、二氯甲烷、甲醇，三者的體積比為7∶2∶7,流速1 mL/min。使用二極管檢測器(Waters 2996 photo diode-array detector)在260～600 nm范圍內檢測光的吸收峰,記錄所有的峰圖和特征光譜。同時,用番茄紅素和β-胡蘿卜素的標準樣品進行HPLC分析,作為陽性對照,將其特征光譜、保留時間與待測樣品進行比較,采用HITACHI軟件(EZChrom Elite for Hitachi Version 3.1.5a)分析算出樣品中番茄紅素和β-胡蘿卜素的質量濃度。

2結果與分析

2.1SlAMSH3基因擴增與測序

以番茄cDNA為模板,分別以AMSH3-F1和AMSH3-R1為引物進行PCR 擴增,產物進行電泳檢測顯示,擴增產物為一條特異條帶,如圖1所示。

由圖1可知，與預期的番茄SlAMSH3基因片段大小1 740 bp一致。測序結果序列與番茄SlAMSH3基因的預測序列一致。

M—DNA marker DL2000 plus　1.目的基因

2.2表達載體鑒定

用XbaⅠ和SacⅠ進行雙酶切得到與預期結果相同的SlAMSH3片段,如圖2所示，證明SlAMSH3已經連接到植物表達載體pBI121上。

M—DNA marker DL2000 plus

2.3轉基因植株的鑒定

通過植物組織培養獲得轉基因番茄植株,從葉片中提取轉基因植株的基因組DNA,利用植物表達載體pBI121 攜帶的新霉素磷酸轉移酶Ⅱ(NPTⅡ)基因對植株進行陽性鑒定,預期擴增片段長度為 857 bp。共得到組培苗8株,其中6株經過鑒定為轉基因番茄苗。

8株的PCR鑒定結果如圖3所示，圖3表明,對照野生型植株未能擴增出857 bp 的條帶,而抗性植株和陽性對照擴增出857 bp 的條帶,說明攜帶NPTⅡ基因的載體片段已整合于受體植株核染色體組中。

M—DNA marker DL2000 plus

2.4轉基因植株的表型

pBI121-TMF7-SlAMSH3轉基因植株與野生型相比,具有明顯差異。轉基因植株的果實顏色在各生長發育時期均比野生型植株的果實要更深一些,更綠一些。成熟轉基因植株的果實也比野生型植株的果實更紅一些。

2.5SlAMSH3的表達水平

根據實時熒光定量PCR的分析結果,分析轉基因植株果實中過表達基因SlAMSH3的表達水平,結果如圖4所示,轉基因植株SLAMSH3基因的表達水平很高。說明轉入pBI121-TMF7-SlAMSH3植物過表達載體后,番茄SlAMSH3基因得到了顯著過表達(p<0.05)。

圖4　轉基因番茄SlAMSH3表達實時熒光定量PCR分析

2.6果實葉綠素質量濃度的測定

每一植株取綠熟期番茄果實各6個,每組重復測定3次，果實葉綠素的質量濃度如圖5所示。由圖5可看出,轉基因植株果實的總葉綠素和葉綠素a的質量濃度比野生型分別提高約178.61% 和185.51%。

圖5　野生型和轉基因番茄果實葉綠素質量濃度

2.7番茄紅素及β-胡蘿卜素質量濃度的測定

野生型與轉基因番茄果實番茄紅素和β-胡蘿卜素質量濃度如圖6所示。

由圖6可以看出,在轉基因番茄果實熟果中的番茄紅素和β-胡蘿卜素的質量濃度均比野生型中兩者的質量濃度高，分別提高約40.53%和74.86%。

圖6　番茄紅素和β-胡蘿卜素質量濃度分析

2.8果實糖度、直徑、質量及硬度的測定

取每一植株紅熟期番茄果實各15個,每組3次重復測定果實糖度、直徑、單果質量及硬度,結果如圖7所示。

由圖7可看出,轉基因番茄果實的糖度、質量、直徑及硬度比野生型番茄的均有所提高，但無顯著性的差異。

圖7　紅熟期番茄果實糖度、直徑、質量及硬度的分析

3結果與討論

研究表明,在植物體內,SlAMSH3基因影響細胞器的發育[8],本文將番茄的SlAMSH3基因通過pBI121-TMF7載體在番茄中過表達,實時熒光定量PCR檢測結果顯示,轉基因植株中SlAMSH3基因在番茄植株得到了過表達,轉基因植株表現出綠果顏色變深性狀。

本實驗研究表明,過表達SlAMSH3的轉基因植株綠熟期果實的總葉綠素質量濃度比同期野生型果實提高約178.61%。過表達SlAMSH3的轉基因植株紅熟期果實的番茄紅素和類胡蘿卜素的質量濃度比野生型的分別提高約40.53%和74.86%。過表達SlAMSH3的轉基因番茄果實的糖度、質量及硬度均比野生型番茄的有所提高，但無顯著性的差異。

本文將SlAMSH3在番茄植株中過表達,并且發現SlAMSH3過表達可以提高番茄果實中的葉綠素、番茄紅素、類胡蘿卜素等的質量濃度,并沒有對SlAMSH3的相關功能及其作用機理作出分析,后續試驗將深入研究SlAMSH3在番茄中的功能作用及其可能的作用機制。

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(責任編輯閆杏麗)

Tomato de-ubiquitination enzymes AMSH3 gene improving tomato quality

LIU Yan-hong,LI Guang-wei,LIU Yong-sheng

(School of Biotechnology and Food Engineering,Hefei University of Technology,Hefei 230009,China)

Abstract:AMSH3 enzyme is a member of de-ubiquitination enzymes in MPN(+)/JAMM protease family,which can bind ubiquitinated protein ubiquitin molecule.The similarities of the de-ubiquitination enzyme gene SlAMSH3 in tomato were 81% and 71% in nucleic acid and protein levels in comparison with AtAMSH3 enzyme gene in Arabidopsis thaliana.In Arabidopsis,the formation of vacuole and the pathway to transport vacuole protein are affected by de-ubiquitination enzymes AMSH3.In this paper,the SlAMSH3 fruit-specific overexpression vector was constructed and transferred into tomato plants through a reproducible agrobacterium-mediated transformation.The transgenic plants expressing SlAMSH3 highly in fruit were confirmed by screening.The analysis result of fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)showed that the expression quantity of SlAMSH3 increased in the transgenic plants compared to that of wild type plants.The chlorophyll concentration of the positive tomato at green ripe stage and the single fruit weight,brix content,firmness,lycopene concentration and β-carotene concentration of the fruit at red ripe stage were determined.The chlorophyll concentration,lycopene,β-carotene in the transgenic tomato fruit were improved 178.61%,40.53% and 74.86% respectively,while other indicators showed no significant differences.Therefore,fruit-specific overexpression of tomato SlAMSH3 is a useful genetic engineering approach to improve fruit quality.

Key words:AMSH3 gene;fruit-specific overexpression;genetic transformation;transgenic tomato;fruit quality improvement

收稿日期：2015-01-03；修回日期：2015-04-24

基金項目：國家自然科學基金資助項目(31171179)

作者簡介：劉艷紅(1989-),女,河南周口人,合肥工業大學碩士生;劉永勝(1964-),男,重慶市人,博士,合肥工業大學教授，博士生導師.

doi:10.3969/j.issn.1003-5060.2016.04.023

中圖分類號:Q785;S641.2

文獻標識碼：A

文章編號：1003-5060(2016)04-0548-06