豬肌肉組織中堿性磷酸酶的純化及特性研究

李紅衛,王開萍,吳　娛,唐正江,湯　飛,劉國慶,2

(1.合肥工業大學 生物與食品工程學院,安徽 合肥　230009;2.安徽省皖江禽產業研究院，安徽 宣城　242000)

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豬肌肉組織中堿性磷酸酶的純化及特性研究

李紅衛1,王開萍1,吳娛1,唐正江1,湯飛1,劉國慶1,2

(1.合肥工業大學 生物與食品工程學院,安徽 合肥230009;2.安徽省皖江禽產業研究院，安徽 宣城242000)

摘要:豬肌肉組織中堿性磷酸酶經預冷的正丁醇提取、硫酸銨分級沉淀、DEAE-52纖維素離子交換柱層析、Sephacryl S-200凝膠過濾層析得到堿性磷酸酶。純化倍數為57.34,比活力為28.77 U/mg。通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)分析可得該酶的分子質量為66 kDa。該酶催化底物對硝基苯磷酸二鈉(p-NPP)的最適pH值為9.7,最適溫度為30℃，Mg2+和Ca2+對其有激活作用,Zn2+和EDTA對其有抑制作用。

關鍵詞:豬肌肉組織;堿性磷酸酶;分離純化

堿性磷酸酶(AKP)是一種同源二聚體的糖蛋白,該酶屬于磷酸酶,在堿性條件下(最適pH值為10左右)能夠通過水解磷酸單酯將底物分子上的磷酸基團除去,產生無機磷酸和對應的醇、酚或糖。AKP不僅參與鈣磷代謝,維持體內適宜的鈣磷比例,而且還與蛋白的分泌與合成相關,在生物體的物質代謝中具有重要作用[1-2]。近年來,很多研究者從不同動物組織中分離純化出了堿性磷酸酶[3-5],并對其性質做了大量的研究。文獻[6]從雞肝中分離純化了雞肝堿性磷酸酶,以對硝基苯磷酸二鈉(p-NPP)為底物,測得該酶的最適pH值為10.5,最適溫度為40℃。甲醇、乙二醇與丙三醇均對其活性有不同程度的抑制作用。文獻[7]從鴨肝中分離純化出電泳純的堿性磷酸酶,該酶純化倍數達58.3倍,比活力為337.4 U/mg。經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)和凝膠過濾測得該酶的亞基分子量為60.5 kDa；以磷酸苯二鈉為底物,測得該酶的最適pH值為9.0,最適溫度為40℃；Na+、K+、Li+等一價離子對該酶活性基本無影響,Mg2+、Mn2+對該酶活性有激活作用,Cd2+對該酶活性有抑制作用。文獻[8]從牛小腸中分離純化出牛小腸堿性磷酸酶,提純倍數為50.69,比活力為48.87 U/mg;經SDS-PAGE呈現單一條帶;該酶催化對硝基苯磷酸二鈉(p-NPP)水解反應的最適pH值為9.7,pH值小于6.5大于11.5均不穩定;最適溫度為45℃,高于50℃不穩定;利用SDS-PAGE測定酶亞基的分子量為66 kDa;Mg2+、Mn2+和Ca2+對酶有不同程度的激活作用,Zn2+和EDTA對酶有抑制作用。文獻[9]分離純化番鴨小腸中堿性磷酸酶,并對其酶促動力學性質進行研究,結果表明,該酶催化磷酸苯二鈉水解反應時最適溫度為45℃,最適pH值為9.7;Mg2+對堿性磷酸酶活性有明顯激活作用;Cd2+質量濃度小于0.4 mg/L時對堿性磷酸酶有激活作用,而質量濃度高于0.4 mg/L時則有抑制作用;Cu2+對堿性磷酸酶活性有明顯抑制作用。

不同來源的堿性磷酸酶提取方法和特性存在差異性,目前關于豬肉中堿性磷酸酶分離純化的相關報道不多,本文旨在建立豬肌肉組織中堿性磷酸酶分離純化方法,并進一步探討該酶的相關特性。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1材料

豬(Sus domesticus)肌肉組織采自安徽省春然食品有限公司屠宰基地(合肥)健康活豬豬背最長肌,采用無菌薄膜包裝后置于0～4℃冷卻貯藏。

1.1.2試劑

DEAE-纖維素(DEAE-52)和丙烯葡聚糖凝膠S-200(Sephacryl S-200)購于GE Healthcare公司;丙烯酰胺(電泳級)、甲叉雙丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)、過硫酸銨,購于sigma公司;牛血清白蛋白(BSA),購于上海江萊生物科技有限公司;對硝基苯磷酸二鈉(p-NPP),購于天津億鑫化工有限公司;正丁醇、氯仿、碳酸氫鈉、碳酸鈉、甘氨酸、HCl、EDTA、NaCl、NaOH、硫酸銨固體、BaCl2、考馬斯亮藍,均購自國藥集團化學試劑有限公司;2×蛋白質電泳loading buffer,購于北京天根生物公司;蛋白質marker,購于TaKaRa(大連)公司。

1.2儀器與設備

AR1140型電子分析天平(德國Sartorius公司)、臺式高速離心機(上海安亭科學儀器廠)、CR22G型高速冷凍離心機(日本日立公司)、721E型紫外可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司)、HH-2孔數顯水浴鍋(江蘇金壇市環宇科學儀器廠)、凝膠電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司)、層析柱(16 mm×600 mm)(上海精科實業有限公司)、PHSCAN10型pH計(METER公司)、ULT-487型超低溫冰箱(美國Revco公司)、超聲波清洗儀(江蘇昆山市超聲儀器有限公司)、BSZ-100電腦自動部分收集器(上海精科實業有限公司)、GmbH紫外凝膠成像系統(美國Biostep公司)。

1.3方法

1.3.1堿性磷酸酶的分離純化

參考文獻[10]的方法并加以修改。稱取100 g豬肉用蒸餾水漂洗干凈,清除結締組織和脂肪后剪碎,與預冷的0.05 mol/L Tris-HCl 緩沖液(含0.02 mol/L NaCl,pH值為7.5)按每克豬肉加入3 mL緩沖液的比例混合,研磨均勻,置4℃冰箱中抽取1 h。將勻漿液離心(4℃,10 000 r/min,15 min),取上清,加入1/5體積預冷的正丁醇,4℃抽提過夜進行除脂。次日,離心(4℃,10 000 r/min,15 min),取其中清液加入硫酸銨固體至飽和度為0.35,4℃冰箱靜置4 h后離心(4℃,10 000 r/min,20 min),取其中清液并加入固體硫酸銨至飽和度為0.65,4℃冰箱中靜置4 h，然后離心,取固相。

將固相溶于0.05 mol/L Tris-HCl(pH值為 7.5,下同)緩沖液中,用蒸餾水透析脫鹽至透析水，加入BaCl2無白色沉淀為止。將蛋白于4℃ 10 000 r/min離心20 min,取上清液測定蛋白濃度及酶活力。

透析后取樣液5 mL過DEAE-52纖維素柱,用含0～1.0 mo1/L NaCl的Tris-HCl作梯度洗脫,流速為0.5 mL/min,每管收集5 mL,在280 nm分別測定各管的蛋白質濃度和AKP 酶活力。合并活力峰附近的幾管后,透析,冷凍干燥濃縮。

取蛋白酶250 mg溶于5 mL的0.05 mol/L Tris-HCl 緩沖液中,過Sephacryl S-200凝膠過濾柱,以0.1 mol/L的NaCl溶液(含0.05 mol/mL Tris-HCl)為洗脫液,洗脫流速為0.3 mL/min,每管3 mL,分別測定各管蛋白質濃度和AKP酶活力,收集活力峰,透析,濃縮,得純化樣品。

1.3.2酶活力的測定

采用以p-NPP為底物的金氏法[11]測定其酶活力,并在該方法規定的條件下,定義每15 min生成1 μmol酚所需的酶量為1個酶活力單位(U)。

1.3.3蛋白質濃度的測定

采用Bradford法[12]測定蛋白質濃度,牛血清蛋白為標準樣品。

1.3.4SDS-PAGE

采用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行鑒定,分離膠體積分數為10%,濃縮膠體積分數為10%;考馬斯亮藍R-250染色。

1.3.5堿性磷酸酶特性研究

(1)最適pH值及其酸堿穩定性的測定。將3 mL不同pH值的0.05 mol/L Tris-HCl 緩沖液、0.1 mL的蛋白質酶液,在37℃預熱5 min,加入緩沖液的復合基質液1.9 mL(1.8 mL 0.1 mol/L Na2CO3-NaHCO3(pH值為9.5)緩沖液中加入0.1 mL 20 mmol/L p-NPP,37℃預熱10 min),置于37℃恒溫10 min,接著加入1.0 mL堿性溶液終止反應,測定每管的酶活力。以pH值為橫坐標,相對酶活為縱坐標繪制pH值-活性曲線,求出堿性磷酸酶的最適pH值。

將1.8 mL不同pH值的0.05 mol/L Tris-HCl 緩沖液、0.1 mL的蛋白質酶液,在37℃預熱1 h,再加入0.1 mL 20 mmol/L p-NPP,混勻,置于37℃恒溫10 min,接著加入1.0 mL堿性溶液終止反應,測定每管的酶活力。對照樣則在加入p-NPP之前先加入1.0 mL堿性溶液。以pH值為橫坐標,相對酶活為縱坐標繪制酸堿穩定曲線,并分析堿性磷酸酶的酸堿穩定范圍。

(2)最適溫度及其熱穩定性的測定。參考上述方法。采用pH值為9.7的緩沖液,溫度分別設定為10、20、25、30、35、40、45、50、55、60℃,保溫10 min,測定酶活力。以反應溫度為橫坐標,相對酶活為縱坐標,繪制溫度-活性曲線,并求出堿性磷酸酶的最適溫度。

采用pH值為9.7的緩沖液,將3 mL緩沖液、0.1 mL的蛋白質酶液,0.1 mL 20 mmol/L p-NPP,熱處理溫度分別為0、10、20、25、30、35、40、45、50、55、60℃,熱處理時間為30 min后,立即以流動水冷卻并置于37℃恒溫水浴鍋中預熱2 min,37℃預熱的復合基質液各加1.9 mL,37℃精確反應10 min,各加1.0 mL堿性溶液終止反應,測定酶活。以處理溫度為橫坐標,相對酶活為縱坐標,繪制熱穩定曲線,并分析堿性磷酸酶的熱穩定范圍。

1.3.6金屬離子及EDTA對AKP酶活的影響

在酶最適溫度與pH值下,在1.8 mL 0.1 mol/L碳酸鹽緩沖液、0.1 mL蛋白質酶液中,分別加入0.2 mL 20 mmol/L MgCl2、ZnCl2、EDTA、CaCl2及0.2 mL蒸餾水,37℃預熱5 min,再加入0.1 mL 37℃預熱p-NPP,37℃精確反應10 min,各加1.0 mL堿性溶液終止反應,測酶活力,分析其對AKP酶活的影響。

2結果與分析

2.1AKP酶的純化

將豬肉經過預冷正丁醇的處理、硫酸銨分級分離、離心、透析等步驟處理后的粗酶液,經DEAE-52纖維素離子交換柱層析得到多組分蛋白,過Sephacryl S-200凝膠柱層析得到多組分蛋白，分別留樣測定蛋白濃度和活性。計算出總蛋白質量、總活力、比活力和純化倍數，見表1所列。

表1　豬肌肉組織中AKP的分離純化

2.2DEAE-52離子交換層析

將粗酶液溶解于0.05 mol/L的Tris-HCl的平衡緩沖液,經以0.05 mol/L的Tris-HCl的平衡緩沖液平衡過的DEAE-52離子交換層析柱(16 mm×600 mm)，通過0～1 mol/L NaCl的Tris-HCl緩沖液梯度洗脫,結果如圖1所示。

圖1中管數以每管吸取0.5 mL計算，由圖1可知，主要有2個活力峰,其中第1個峰主要在第15～17管區域,第2個峰在第29～31管區域。由于第2個峰在0.6 mol/L的NaCl緩沖液洗脫的梯度下于280 nm處,測得較高的光密度值,同時酶活力也明顯高于第1個峰,故將第29～31管酶液收集于一管,經低溫冷凍干燥濃縮后待用。

圖1　AKP的DEAE-52離子交換層析圖

2.3Sephacryl S-200凝膠過濾層析

經上述純化的酶溶解于0.05 mol/L的Tris-HCl的平衡緩沖液,經該平衡緩沖液平衡過的Sephacryl S-200層析柱(16 mm×600 mm)，通過0.1 mol/L NaCl的Tris-HCl緩沖液洗脫，結果如圖2所示。圖2中，管數以每管吸取0.4 mL計算。圖2中出現了2個主要的活力峰,第1個在第14～16管區域,第2個在第34～36管區域,再比較2個活力峰區域的光密度值,第2個峰明顯高于第1個峰,故收集第34～36管的酶液于一管中,低溫冷凍干燥濃縮得到酶純品。

圖2　AKP的Sephadex S-200 凝膠過濾層析

2.4SDS-PAGE電泳圖

取經Sephacryl S-200凝膠過濾純化的酶,通過SDS-PAGE電泳得到的電泳如圖3所示。

1.堿性擴增　2.蛋白質marker

圖3中，第1列為純化后的樣品；第2列為蛋白質分子量標準，分別為:肌球蛋白(200 kDa)、β-半乳糖苷酶(116 kDa)、磷酸酶b(97.2 kDa)、牛血清蛋白(66.4 kDa)、卵清蛋白(44.3 kDa)、碳酸苷酶(29.0 kDa)、胰蛋白酶抑制劑(20.1 kDa)、溶菌酶(14.3 kDa)、抑肽酶(6.5 kDa)。從圖3可以看出,純化后的結果顯現出單一區帶,說明該酶已達到電泳純，AKP的分子量大約為66 kDa。

2.5最適pH值測定及其酸堿穩定性

pH值對AKP活力的影響如圖4所示,從圖4可知,在pH值小于9.5的情況下,酶活力隨pH值的增加而上升；在其大于10時,酶活力隨pH值的增大而下降。酶在pH值為9.0～11.0時活力較高,在pH值為9.7時活力最高,所以最適pH值為 9.7。

圖4　pH值對AKP活力的影響

pH值對AKP穩定性的影響如圖5所示。由圖5可得,酶在pH值為7.0～10.5時酶活力變化不大,在該范圍之外酶活力變化劇烈,說明在pH值為7.0～10.5時較穩定。

圖5　pH值對AKP穩定性的影響

2.6最適溫度及其熱穩定性

溫度對AKP活力的影響如圖6所示。從圖6可知,在溫度高于30℃時,酶活力隨溫度的增大而下降;在低于30℃時,酶活力隨溫度的增大而上升。AKP在30℃時酶的活力最高,說明其最適溫度為30℃。

溫度對AKP穩定性的影響如圖7所示,由圖7可知,當溫度高于40℃時,酶活力明顯下降,說明酶高于40℃不穩定,易變性失活。

圖6　溫度對AKP活力的影響

圖7　溫度對AKP穩定性的影響

2.7金屬離子及EDTA對AKP 酶活力的影響

Mg2+、Zn2+、Ca2+、EDTA 、H2O的相對酶活分別為120%、74%、135%、49%、100%,說明EDTA對AKP有較強的抑制作用,Mg2+和Ca2+對AKP有明顯的激活作用,而Zn2+對AKP有抑制作用。

3討論

本文通過正丁醇對樣品的粗提、硫酸銨的分級分離得到粗蛋白酶,再經過離子交換層析、凝膠過濾等技術手段,從豬肌肉組織中純化出堿性磷酸酶。

經SDS-PAGE電泳得到豬肌肉組織AKP分子量為66 kDa左右,與牛小腸的66 kDa、南方鲇[13]的66.2 kDa大致相同,而鴨肝AKP分子量為60.5 kDa,大涼疣螈[14]為48.41 kDa,大腸桿菌[15]為40 kDa,家蠶[16]約為55 kDa,從而證明了不同種屬的AKP的大小不同。純化倍數達57.34倍,與鴨肝的58.3倍、牛小腸的50.69倍大致相似，而比背角無齒蚌19倍[17]、白蠟蟲16.8倍[18]、瘦肉型(PIC344)精液11.5倍[19]、大腸桿菌18.8倍[20]均有較大提高,說明該方法可有效純化豬肌肉組織。

AKP的性質因動物物種的種屬不同而不同,實驗結果表明,豬肌肉組織中AKP的最適溫度為30℃,而牛小腸中AKP和合浦珠母貝[20]的為45℃,雞肝AKP的為40℃,差異較明顯。豬肌肉組織AKP最適pH值為9.7,與合浦珠母貝和牛小腸相同、與背角無齒蚌pH值相近,與其他動物則有明顯的差異,說明不同種類動物AKP的性質不同。

EDTA對堿性磷酸酶有較強的抑制作用,證明豬肉中堿性磷酸酶是一種金屬酶[21],金屬離子對維持其分子結構和催化活性均有重要作用,研究不同金屬離子的影響,對于探討AKP的作用機理,調節體內鈣磷代謝等具有一定意義。Mg2+和Ca2+對AKP有明顯的激活作用,此類離子應該為豬肌肉AKP的有益離子,而Zn2+對AKP有抑制作用,當濃度達到20 mmol/L時,酶活力就開始有所下降。因此,AKP作為一種重要的調節酶參與動物的生長發育,研究金屬離子與該酶活力的關系,有利于選擇合適的金屬離子作為飼料添加劑,這樣在保證動物產品食用安全的情況下,有利于提高經濟效益,因而對于肉豬飼料的改進值得進一步研究。

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(責任編輯閆杏麗)

Purification and properties of alkaline phosphatase from pig muscle tissue

LI Hong-wei1,WANG Kai-ping1,WU Yu1, TANG Zheng-jiang1,TANG Fei1,LIU Guo-qing1,2

(1.School of Biotechnology and Food Engineering,Hefei University of Technology,Hefei 230009,China;2.Anhui Wan Jiang Poultry Industry Research Institute,Xuancheng 242000,China)

Abstract:Alkaline phosphatase(AKP)from pig muscle tissue was extracted by the cold n-butanol and precipitated with ammonium sulfate,ion-exchange chromatography was made with DEAE-52 cellulose column and gel filtration chromatography through Sephacryl S-200.The purification multiple was 57.34,and the specific activity was 28.77 U/mg.SDS-polyacrylamide gel electrophoresis(PAGE)result showed a single band with the relative molecular mass of 66 kDa.The optimum pH value for the enzyme to catalyze the hydrolysis of phenylphosphonic acid disodium salt(p-NPP)was 9.7 and the optimum temperature was 30℃.Mg2+and Ca2+could activate the enzyme while Zn2+and EDTA inhibit it.

Key words:pig muscle tissue;alkaline phosphatase(AKP);seperation and purification

收稿日期：2015-01-09；修回日期：2015-03-10

基金項目：安徽省科技攻關計劃資助項目(1401032006)

作者簡介：李紅衛(1988-),男,安徽宿州人,合肥工業大學碩士生;劉國慶(1963-),男,安徽蕪湖人,博士,合肥工業大學教授,碩士生導師.

Doi:10.3969/j.issn.1003-5060.2016.04.025

中圖分類號:Q814.1

文獻標識碼：A

文章編號：1003-5060(2016)04-0560-06