干擾素誘導蛋白204抑制大鼠血管外膜成纖維細胞增殖*

龍向淑， 黃　晶， 吳　強**， 田茂波， 宋　方， 肖　燕

(1.貴州醫科大學附屬人民醫院 心內科， 貴州 貴陽　550002； 2.貴州醫科大學 內科學教研室， 貴州 貴陽　550004)

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·專題研究·

干擾素誘導蛋白204抑制大鼠血管外膜成纖維細胞增殖*

龍向淑1， 黃晶1， 吳強1**， 田茂波1， 宋方1， 肖燕2

(1.貴州醫科大學附屬人民醫院 心內科， 貴州 貴陽550002； 2.貴州醫科大學 內科學教研室， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 探討干擾素誘導蛋白204(p204)對大鼠血管外膜成纖維細胞(VAFs)增殖的影響及可能機制。方法： 將大鼠VAFs分為空白對照組(N組)、非特異性小干擾RNA(siRNA)轉染組(control組)、IFN-α干預組(IFN-α組)及Ifi204 siRNA轉染組(Ifi204 siRNA組)，給予相應處理；應用Real Time qRT-PCR法檢測p204 mRNA表達， MTT比色法測定細胞活力，流式細胞儀分析細胞周期， Western blot 檢測p204、Ras蛋白表達及Raf與Erk磷酸化水平。結果： 與N組比較，IFN-α組p204 mRNA和蛋白表達上調(P<0.05)，細胞活力下降，細胞周期G1/S轉換下調(P<0.05)，伴Ras蛋白表達減少，Raf及Erk磷酸化水平下降(P<0.05)；Ifi204 siRNA組p204 mRNA及蛋白表達下調(P<0.05)，細胞活力增高，G0/G1期細胞減少，S期細胞增多(P<0.05)，Ras蛋白表達增多，Raf及Erk磷酸化水平升高(P<0.05)；而control組上述指標與N組相比，差異無統計學意義(P>0.05)。結論： p204表達可抑制大鼠VAFs增殖，Ras信號通路可能參與p204對VAFs增殖的調控。

[關鍵詞]干擾素誘導蛋白204； 成纖維細胞； 增殖； Ras信號通路； 大鼠，Sprague-Dawley

血管外膜成纖維細胞(vascular adventitial fibroblasts, VAFs)是血管外膜最主要的細胞成分。既往認為，在物理損傷、炎癥反應及化學刺激等因素誘發的血管重塑過程中，VAFs僅對血管壁起著營養和支持作用；近期研究顯示，當血管內膜損傷病變發生時，VAFs首先被激活，活化的VAFs增殖、遷移和合成細胞外基質的能力增強，同時分泌細胞因子、生長因子等促進血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)和血管內皮細胞(vascular endothelial cells，VECs)增殖，共同參與動脈粥樣硬化、冠狀動脈成形術后再狹窄及高血壓等血管重塑性疾病(vascular remodeling disease，VRD)的發生、發展[1-4]。干擾素(interferon，IFN)誘導蛋白204(interferon inducible protein 204，p204)是IFN誘導蛋白200(interferon inducible protein 200，p200)家族的鼠類蛋白成員。p204或其同源蛋白IFN誘導蛋白16(interferon inducible protein 16, IFI16)對血管壁細胞生物學功能影響的前期研究顯示p204和IFI16分別表達于大鼠和人VAFs并通過影響P53/P21表達而抑制VAFs增殖和遷移[5-7]；p204在大鼠VSMCs表達并可能通過抑制Ras信號通路激活而影響VSMCs增殖，但Ras信號通路是否參與p204對大鼠VAFs增殖的調控尚未明了。本研究旨在探討p204對大鼠VAFs增殖及Ras信號通路的影響，為臨床防治VRD提供新思路。

1材料和方法

1.1材料

清潔級6周齡SD大鼠(雌性1只，雄性1只)，體質量100～120 g，購自第三軍醫大學實驗動物中心。IFN-α購自北京三元基因工程有限公司。DMEM高糖型細胞培養液和胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自Hyclone公司。即用型細胞免疫組化試劑盒和顯色試劑盒購自武漢博士德公司。非特異性小干擾RNA(small interferon RNA，siRNA)和p204抗體購自Santa Cruz公司；p204基因(Ifi204 )siRNA由寶生物工程(大連)有限公司合成，其序列為：F 5′-AGG CAA CCA AAG UUA GUG UTG-3′，R5′-ACA CUA ACA UUG GUU GCC UAG-3′。LipofectamineTM 2000 Reagent 購自Invitrogen公司。四甲基偶氮唑鹽[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT]購自Sigma公司。細胞周期檢測試劑盒和Tubulin抗體購自碧云天公司。TRNzol 總RNA提取試劑購自北京天根公司；RT-PCR兩步法試劑盒購自TaKaRa公司。PCR擴增引物由寶生物工程有限公司合成(大連)。Vimentin、Ras、磷酸化Raf(p-Raf)及磷酸化細胞外信號調節激酶44/42(p-Erk 44/42)抗體購自Abcam公司。

1.2方法

1.2.1VAFs培養及實驗分組采用組織塊貼壁法培養SD大鼠原代主動脈VAFs，經傳代反復采用差速貼壁法去除VSMCs而純化VAFs。采用Vimentin抗體按細胞免疫組化試劑盒說明書操作鑒定VAFs。取第3～5代細胞用于實驗。實驗分4組：空白對照組(N組)、非特異性siRNA轉染組(Control組)、Ifi204 siRNA轉染組(Ifi204 siRNA組)和IFN-α干預組(IFN-α組)。調整細胞濃度為2×105個/孔接種于6孔板中，每組設3個復孔。Control組與Ifi204 siRNA組按脂質體轉染試劑說明書操作分別同步轉染非特異性siRNA及Ifi204 siRNA干預6 h，IFN-α組用終濃度為2×106U /L的IFN-α干預6 h，N組予按時更換培養液，培養至48 h收集細胞。

1.2.2p204 mRNA的檢測Real Time qRT-PCR檢測p204 mRNA表達。收集各組細胞，按TRzol總RNA提取試劑盒說明提取總RNA，取總RNA 1 μg 按反轉錄試劑盒說明書操作反轉錄合成cDNA，取cDNA產物3 μL進行PCR循環，以β-actin作為內參對照，采用2﹣ΔΔCt法計算p204 mRNA相對含量。引物序列及擴增長度,p204F 5′-TCA TGG TCC CAA ACA AGT GA-3′，R 5′-ACC CAT TGC ACC CAA AAT AA-3′，擴增長度200 bp；β-actin F 5′-TGG CAC CAC ACC TTC TAC AAT G-3′，R 5′-TCA TCT TCT CGC GGT TGG C-3′，擴增長度103 bp。PCR擴增條件：預變性95 ℃ 30 s，變性95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s延長，擴增40個循環。

1.2.3p204、Ras蛋白表達及Raf與Erk磷酸化水平的檢測Western blot 檢測p204和Ras蛋白表達及Raf與Erk磷酸化水平。用細胞裂解液裂解各組細胞提取總蛋白，BCA法定量蛋白并按每組樣品60 μg/孔上樣，用10% SDS-PAGE分離，電轉至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉2 h，去除封閉液，加入1∶500稀釋的一抗， 4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3次，加入按1∶5 000稀釋的二抗(辣根過氧化物酶標記)，搖床孵育2 h(常溫)，收集二抗，TBST搖床漂洗3次。取ECL化學發光試劑覆蓋PVDF膜，X光膠片曝光、顯影及定影后掃描，用圖像軟件根據信號強弱對條帶進行灰度分析。

1.2.4VAFs細胞活力檢測MTT比色法測定細胞活力。收集對數增殖期細胞，按細胞數3×103個/孔接種于96孔板，按上述分組進行相應干預，每組設3個復孔。采用平板離心機離心沉淀細胞后吸盡上清液，每孔加入150 μL 二甲基亞砜，置旋轉搖床上低速振蕩10 min，酶聯免疫儀490 nm波長檢測各孔吸光度A值。

1.2.5VAFs細胞周期檢測按細胞周期檢測試劑盒說明書操作檢測細胞周期。首先消化細胞，離心，1 000 r/min，5 min，棄舊的培養基，加入冰浴預冷的PBS 1 mL，重懸，再次離心；再加入冰上預冷的70 %乙醇1 mL，重懸并混勻，4 ℃固定24 h，離心，1 000 r/min，5 min，加入冰浴預冷的PBS 1 mL，重懸并離心；每個實驗組的樣品中加入500 μL碘化丙啶染色液，重懸并混勻，在37 ℃的水浴箱中，避光水浴30 min；然后用200鉬過濾網過濾各組細胞；用流式細胞儀進行VAFs細胞周期的檢測。

1.3統計學方法

2結果

2.1p204 mRNA和蛋白表達

與N組比較，IFN-α組p204 mRNA和蛋白表達增多，Ifi204 siRNA組p204 mRNA和蛋白表達減少(P<0.05)；而Control組與N組之間p204 mRNA和蛋白表達的差異無統計學意義，表1。

表1　各組VAFs p204 mRNA和

(1)與N組比較，P<0.05

2.2VAFs活力及細胞周期

與N組比較，IFN-α組的MTT吸光度A值降低(P<0.05)，G0/G1期細胞增多，S期細胞減少(P<0.05)；Ifi204 siRNA組MTT吸光度A值增高(P<0.05)，G0/G1期細胞減少，S期細胞增多(P<0.05)；Control組MTT吸光度A值、G0/G1期細胞及S期細胞與 N組之間的差異無統計學意義，見表2。

表2　各組大鼠VAFs增殖情況

(1)與N組比較，P<0.05

2.3Ras蛋白表達和Raf及Erk磷酸化水平

與N組比較，IFN-α組Ras蛋白表達減少，Raf及Erk磷酸化水平降低(P<0.05)；Ifi204 siRNA組Ras蛋白表達增多，Raf及Erk磷酸化水平升高；而Control組上述指標與N組之間的差異無統計學意義，見圖1。

3討論

各種理化因素及炎癥因子導致血管損傷后，血管外膜作為血管壁的第一“感知者”對損傷信號最先發生反應[9]。相對于分泌因子較少的VSMCs，VAFs通過分泌大量的因子或蛋白如轉化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)及細胞粘附分子(cell adhesion molecule，CAM)等來調節血管炎癥反應。因此, 現在越來越多的研究集中在外膜對于VRD如動脈粥樣硬化、冠狀動脈成形術后再狹窄及高血壓等的作用, 而VAFs作為外膜最主要的細胞成分在其中起著非常重要的作用。

(1)與N組比較，P<0.05圖1　Ras蛋白表達及Raf和Erk磷酸化水平(Western blot)Fig.1　Ras proteins and the phosphorylation levels of Raf and Erk

p204是p200家族的鼠類蛋白成員。所有p200家族蛋白在羧基端均含有一個或兩個部分重復及保守的與蛋白和(或)DNA的結合相關的HIN-200結構域，據此結構域部分氨基酸的差異分為A、B及C三型[10]。p204 HIN-200結構域含A和B兩種類型，其A結構域中含有與視網膜母細胞瘤蛋白(retinoblastoma protein, pRb)結合的IXCXE和LXCXE兩個序列，而B結構域中僅包含LXCXE一個序列[10]。p204蛋白氨基酸序列含有多種蛋白激酶潛在的磷酸化位點如cAMP依賴性激酶、蛋白激酶C、鈣調蛋白依賴性激酶及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)等[10-11]。基于其結構特點p204具有調節細胞增殖及分化等功能[12]。前期研究表明，p204在VAFs存在基礎表達，且p204過表達可抑制VAF增殖、遷移并促進其凋亡，在p204表達上調的同時伴隨p53/p21表達增多，提示p204對VAFs的上述效應可能與p204促進p53/p21表達相關[5-6]。本研究顯示，IFN作用于VAFs可致p204 mRNA和蛋白表達增多，VAFs增殖活性下降；針對p204基因保守序列設計的siRNA轉染VAFs后，p204 mRNA和蛋白表達減少，VAFs增殖活性升高，提示VAFs p204表達可能存在IFN誘導性，p204 siRNA可分別在轉錄和翻譯水平有效沉默p204表達，p204具有抑制VAFs增殖的作用。然而，p204除通過影響p53/p21表達調控VAFs增殖外，是否還有其它機制參與尚屬未知。

Ras蛋白是分子量約為21 kD的單體GTP酶，參與典型的G蛋白激活與失活循環。Ras蛋白能被不同上游信號激活而調控多種信號通路，其中Ras/Raf/MEK/Erk是眾多信號通路中具有調節細胞增殖、分化及細胞間功能同步等作用的通路之一。激活型Ras使下游信號蛋白逐級磷酸化而激活，最終活化Erk，活化的Erk轉至細胞核激活不同轉錄因子而產生相應的生物學效應。血管損傷后，包括Ras在內的一些原癌基因表達增多，促進血管壁主要實質細胞VAFs、VSMCs及VECs增殖而導致血管重構。因此，研究如何中斷Ras等介導的信號傳遞過程對VRD的防治具有重要意義。本研究結果顯示，IFN可誘導p204表達增多，伴隨Ras蛋白表達減少，其下游信號蛋白Raf、Erk磷酸化水平下降；反之，p204 基因siRNA沉默p204表達后，Ras蛋白表達增多，其下游信號蛋白Raf和Erk磷酸化水平隨之升高，提示Ras信號通路參與了p204 對VAFs增殖的調控，p204可能具有抑制Ras信號通路激活的作用。

綜上所述，p204表達可抑制大鼠VAFs增殖，Ras/Raf/MEK/Erk信號通路可能參與了p204對VAFs增殖的調控。

4參考文獻

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(2016-02-15收稿，2016-04-27修回)

中文編輯： 周凌； 英文編輯： 劉華

Interferon-α Inducible Protein 204 Inhibition of Proliferation of Vascular Adventitial Fibroblasts in Rats

LONG Xiangshu1, HUANG Jing1,WU Qiang1, TIAN Maobo1, SONG Fang1, XIAO Yan2

(1.DepartmentofCardiology,GuizhouProvincePeople'sHospitalAffiliatedtoGuizhouMedcialUniversity,Guiyang550002,Guizhou,China; 2.DepartmentofInternalMedicine,GuizhouMedcialUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To explore the effect of interferon inducible protein204(p204) expression on rats' vascular adventitial fibroblasts(VAF) proliferation and possible mechanism. Methods: The cultured VAFs were divided into four groups: blank comparison group(N group), nonspecific siRNA transfection group(Control group), IFN-α intervention group(IFN-α group, treated with transfection of IFN-α) and Ifi204 siRNA transfection group(Ifi204 siRNA group, treated with transfection of p204 gene(Ifi204) siRNA ). Expression of p204 mRNA was monitored by real time fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction(Real Time qRT-PCR). Cell vitality was detected by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) method. Cell cycle was analyzed by flow cytometry. Proteins of 204 and Ras and the phosphorylation levels of Raf and Erk were examined by Western blot. Results： Compared with N group, in IFN-α intervention group, the expression of p204 mRNA and protein up-regulated(P<0.05), the cell vitality and the cell cycle of G1/S transition down-regulated(P<0.05), the expression of Ras protein and the phosphorylation levels of Raf and Erk decreased(P<0.05); Compared with N group, in Ifi204 siRNA transfection group, the expression of p204 mRNA and protein down-regulated(P<0.05), the cell vitality increased, cells of G0/G1 stage decreased and S stage increased(P<0.05), the expression of Ras protein and the phosphorylation levels of Raf and Erk increased(P<0.05); There were no statistically significant differences in above-mentioned indicators between Control group and N group(P>0.05). Conclusion： The expression of p204 can inhibit the proliferation of VAFs in rat, and Ras signaling pathway may participate in regulation of p204 on proliferation of VAFs.

[Key words]interferon inducible protein 204; fibroblasts; proliferation; Ras signaling pathway; rats,Sprague-Dawley

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(81260030)； 貴州省科技攻關項目[黔科合LH 字(2014)7023號]

[中圖分類號]R363

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)05-0502-05

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.05.002

**通信作者 E-mail:gzgywq@126.com

網絡出版時間：2016-05-13網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160513.2102.030.html