1-磷酸鞘氨醇對雄性小鼠生殖毒性損害的拮抗作用*

劉丹薇， 潘　衛， 徐國賓， 楊國珍**

(1.貴州醫科大學 醫學檢驗學院 生化學教研室， 貴州 貴陽　550004； 2.北京大學腫瘤醫院 檢驗科， 北京　100142)

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·基礎研究·

1-磷酸鞘氨醇對雄性小鼠生殖毒性損害的拮抗作用*

劉丹薇1， 潘衛1， 徐國賓2， 楊國珍1**

(1.貴州醫科大學 醫學檢驗學院 生化學教研室， 貴州 貴陽550004； 2.北京大學腫瘤醫院 檢驗科， 北京100142)

[摘要]目的： 探討1-磷酸鞘氨醇(S1P)對雄性小鼠生殖細胞毒性損害的拮抗作用。方法: 健康雄性昆明小鼠40只，隨機分為正常對照組、S1P低劑量(0.05 μg/g)、S1P中劑量(0.1 μg/g)、S1P高劑量(0.2 μg/g)組以及環磷酰胺染毒組；正常對照組予生理鹽水，后4組予環磷酰胺，腹腔注射給藥5 d；S1P低、中、高劑量組后再予相應劑量S1P腹腔注射，給藥結束后第30天處死小鼠，分別采集血清、附睪及睪丸樣本，檢測小鼠睪丸精子計數和精子畸形率，比色法測定LDH活力，彗星實驗檢測精子DNA損傷。 結果: 與環磷酰胺染毒組相比，各S1P劑量組精子計數升高，畸形率降低，LDH活力升高，DNA損傷減低，差異有統計學意義(P<0．05)。結論: S1P對雄性小鼠生殖細胞毒性損害具有一定的拮抗作用，能提高精液質量與能量代謝酶LDH的活性，一定程度上抵御細胞DNA損傷。

[關鍵詞]小鼠； 生殖細胞； 藥物拮抗作用； 1-磷酸鞘氨醇

近年來，我國不孕不育家庭逐漸增多，不孕不育現狀不禁令人堪憂，男性原因發生的不育癥占比已經超過了一半。2015年的調查數據顯示，男性與女性不孕不育的發病率為3∶2。過去25年間國內育齡男性精液質量分析報告顯示，精子數量和精子活力均呈下降趨勢。目前，不孕不育問題已成為一個重要的醫學和社會問題。由于不孕不育癥狀發現時，生殖細胞勢必已經發生了損傷，故如何修復和改善這些損傷成為了關鍵。近年來，許多研究發現，1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)可以抑制包括輻射和化學藥物等許多應激因子所致的成體細胞、生殖細胞、胚胎的細胞凋亡[1-4]。此外，外源性S1P可減少早期胚胎細胞凋亡，從而改善胚胎發育潛能[5]。因此，SIP在提高人類輔助生殖技術臨床結局方面有潛在的應用價值。本次研究使用的染毒組藥物是環磷酰胺，它是目前常用的一種烷化劑類抗腫瘤藥物。已經有報道證實，環磷酰胺可對雄性生殖系統造成毒性損害[6]。因此，本研究利用S1P對環磷酰胺導致的生殖毒性進行干預，通過對精液質量的相關指標以及精子DNA損傷情況的檢測，揭示S1P對雄性生殖細胞毒性損害的拮抗作用，從而為生殖毒性損害的防治提供依據。

1材料和方法

1．1材料

1．1．1主要試劑與儀器環磷酰胺(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司)，S1P(美國Sigma公司)，乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(R&D公司)，正常、低熔點瓊脂糖(AMRESCO進口分裝)，二甲基亞砜(DMSO)，曲拉通X-100(Triton-X-100，AMRESCO進口分裝)，三羥甲基氨基甲烷(Tris)，N-十二烷基肌氨酸鈉(SKL，AMRESCO進口分裝)，溴化乙錠(EB，AMRESCO進口分裝)，電子精密天平(JJ500，常熟雙杰測試儀器)，光學顯微鏡(NIKON YS100，日本尼康公司)，正置熒光顯微鏡(Axio Imager A2，德國ZEISS公司)。

1．1．2動物選擇健康成熟昆明種屬雄性小鼠40只，體重25～30 g，購自貴州醫科大學動物實驗中心，動物許可證號SYXK(黔)2012-0001。

1．2實驗方法

1．2．1動物分組與處理將雄性小鼠隨機分為5組，每組8只，分別為正常對照組、S1P低、中、高劑量組、環磷酰胺染毒組。正常對照組按0.01 mL/10 g體重給予生理鹽水；后4組給予環磷酰胺40 mg/kg，連續給藥5 d，染毒期間小鼠自由飲食飲水。S1P低、中、高劑量組在給予環磷酰胺后，間隔2 h再分別根據小鼠體重，按0.05、0.1、0.2 μg/g劑量給予S1P腹腔注射。

1．2．2取材及標本制作 各組于給藥結束后第30天，采用摘眼球法收集小鼠血液，離心取血清，待測LDH；頸椎脫臼后立即打開腹腔，取出雙側附睪、睪丸，附睪研磨后收集精子懸液，測定精子計數、精子活動率、精子畸形率以及DNA損傷。

1．2．3小鼠精子計數、精子活動率、精子畸形率精子活動率：完整分離小鼠附睪，將一側附睪放入盛有1 mL 37 ℃預溫的生理鹽水的EP管中剪碎，用吸管輕輕吹打混勻數次，于37 ℃水浴箱中靜置10 min，待精子自由流出；在室溫條件下，取精子懸液于血細胞計數板上鏡檢，連續計數200個精子中活動精子數，計算活精子百分率=(活精子數/200)×100%。小鼠精子計數：將精子懸液置于60 ℃水浴箱中孵育10 min殺死精子，取精子懸液于血細胞計數板的計數池內，按紅細胞計數法計數中央大方格內5個中方格中精子數，計算精子總數/mL=5個中方格精子總數×5×10×103。小鼠精子畸形率檢查:取1滴精子濾液推片，室溫自然干燥，甲醇固定、干燥，然后用2%伊紅染色1～2 h，流水沖洗、晾干，高倍顯微鏡檢驗，計數1 000條精子中的畸形精子數，精子畸形率(%)=畸形精子數/1 000×100%。

1．2．4小鼠血清以及睪丸勻漿LDH活性測定用ELISA法檢測，具體操作按LDH檢測試劑盒說明書進行。

1．2．5精子DNA損傷測定彗星實驗檢測精子DNA損傷。利用小鼠精子懸液根據Singh彗星實驗基本步驟[7]，參考羅明志[8]等人對于彗星實驗的改良進行操作，熒光顯微鏡下觀察精子拖尾情況并采圖，在200倍物鏡隨機取10個視野拍照，圖像輸入Cometscore彗星實驗圖像分析系統進行分析，得到尾矩(TM)以及Olive尾距(OTM)。

1．3統計學方法

2結果

2.1小鼠精子數量、活動率和精子畸形率

與正常對照組相比，S1P低、中、高劑量組、環磷酰胺染毒組精子數量及精子活動率降低，精子畸形率增高，差異有統計學意義(P<0.01)；與環磷酰胺染毒組相比，S1P低、中、高劑量組、正常對照組精子數量及精子活動率升高，精子畸形率降低差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1　各組小鼠精子數量、精子活動率及畸形率±s)

與環磷酰胺染毒組比較，(1)P<0．05，(2)P<0．01；(3)與正常對照組比較，P<0．01

2.2LDH活性

隨著S1P劑量的增加，小鼠血清和睪丸LDH的活性均逐漸升高。環磷酰胺與染毒組相比，S1P中、高劑量拮抗組LDH活性差異有統計學意義(P<0.05)，S1P低劑量組差異無統計學意義(P>0.05)；與正常對照組相比，S1P低、中劑量拮抗組LDH活性降低，差異有統計學意義(P<0.05)，與S1P高劑量拮抗組差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。各組血清和睪丸之間的LDH活性趨勢見圖1。

表2　各組實驗小鼠血清和睪丸LDH活性±s)

與環磷酰胺染毒組組比較，(1)P<0．05，(2)P<0．01；與正常對照組比較，(1)P<0．05，(2)P<0．01

圖1　各組小鼠血清和睪丸LDH活性Fig.1　Effect of S1P on activity of LDH of serum and testis in each experimental group of mice

2.3小鼠精子DNA損傷

熒光顯微鏡下，可見正常對照組的精子細胞大小均一，為一圓形熒光團，熒光強度均勻，邊緣光滑，基本無拖尾現象(圖2A)；環磷酰胺染毒組精子細胞大部分出現明顯拖尾，尾部熒光強度較強，彗星頭部直徑較正常對照組減小(圖2B)；S1P劑量組隨著拮抗劑量的增加，出現拖尾的細胞逐漸減少，拖尾細胞的拖尾長度也逐漸縮短(圖2C～E)。隨著S1P劑量的增加，TM和OTM逐漸降低(表3)，S1P中、高劑量組與環磷酰胺染毒組相比差異有統計學意義(P<0.05)，S1P低劑量組與染毒組差異無統計學意義(P>0.05)，S1P高劑量組與正常對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)。

表3　各組實驗小鼠生殖細胞DNA損傷情況±s)

(1)與環磷酰胺染毒組比較，P<0．01;(2)與正常對照組比較，P<0.01

注：A為染毒組，B為S1P低劑量組，C為S1P中劑量組，D為S1P高劑量組，E為正常對照組圖2　各組小鼠精子細胞彗星圖像(×200)Fig.2　Comet image of sperm cells in each experimental group of mice

3討論

精液質量是評價雄性生育能力的重要指標，其中精子數量、活動率、精子畸形率是檢測各種理化因子對生殖細胞影響的敏感指標。本次研究結果顯示，S1P劑量組小鼠雖然與正常對照組相比仍有差異，但與單純環磷酰胺染毒組相比，精子數量、活動率顯著增加，精子畸形率顯著降低，精液質量已經明顯改善。其可能的原因是環磷酰胺能對細胞信號傳導通路損傷。目前研究表明，S1P能夠通過與不同受體結合激活細胞內外信號轉導通路，通過與5個G蛋白耦聯受體(G-protein coupled receptor，GPCR)家族蛋白相互作用，觸發不同的細胞反應，促進細胞存活和增殖[9]。故本研究中S1P可能抑制了環磷酰胺對細胞信號通路的損傷，從而對小鼠精子數量和精子畸形率的改變產生了一定的干預作用。另外，本結果顯示S1P高劑量組與正常對照組比較依然有顯著性差異，故下一步將考慮分組時再設計一個更高的劑量，以便達到更顯著的效果。

LDH 是睪丸間質細胞、支持細胞和生精上皮細胞膜和精子的標志酶，其活力改變導致睪酮分泌減少，精細胞生長因子減少，精子的發生和發育受阻，生精功能受損[10]。LDH幾乎存在于所有體細胞中，且有多種同工酶，分別為LDH1～LDH5，睪丸和精子中則是LDHX，其電泳遷移率介于LDH4和LDH5之間。本研究還同時檢測了血清LDH，發現S1P各組血清總LDH活性與睪丸LDH的活性變化相一致，都呈現上升趨勢，且從變化趨勢線斜率上看，睪丸LDH活性較血清總LDH活性稍大，說明血清總LDH活性的升高是由于睪丸LDH活性的升高所致。本研究結果顯示，環磷酰胺染毒組小鼠血清和睪丸LDH 活性顯著降低，提示環磷酰胺可干擾生精細胞能量生成，從而導致成熟精子減少，活力下降。實驗小鼠睪丸LDH隨S1P劑量的增加，活性明顯升高，推測S1P具有一定抗氧化作用，故對于環磷酰胺造成的小鼠睪丸組織損傷具有改善作用。其中，低S1P劑量組睪丸LDH活性雖然與染毒組相比未有明顯差異，但聯系該組的精子活力與畸形率結果，發現已經與染毒組有差異，說明低劑量S1P已經對環磷酰胺的毒性作用產生了一定的抵御作用，而該抵御作用有可能是通過其他途徑來實現。

根據相關報道，彗星實驗對于探索毒物對DNA 的直接損傷、DNA 或染色體突變的可能性的價值較高[11]。本研究在傳統的彗星實驗方法步驟的基礎上增加了梯度脫水的環節，發現膠體在脫水后明顯變薄，使視野中觀察到的精子細胞基本上位于同一平面，提高了采圖效率和結果的可靠性。本研究結果顯示，環磷酰胺染毒組彗星拖尾明顯，證明環磷酰胺在停藥后對睪丸細胞DNA仍有持續的損傷作用，推測是環磷酰胺通過激活活性氧類物質(reactive oxygen species，ROS)，使其超過了機體的抗氧化能力，直接氧化精子DNA堿基，造成精子DNA鏈損傷和斷裂[12]。可能是為保持遺傳分子的完整性，生殖細胞啟動了DNA修復系統。然而當修復失敗，DNA損傷會激活細胞凋亡的發生，以保持基因組的穩定性。而高、中劑量的S1P可以明顯抑制由環磷酰胺引起的DNA損傷。低劑量S1P組與染毒組沒有明顯統計學差異，因本次結果只統計200個細胞，猜想可能是由于實驗統計細胞量不夠大，致使最終結果未能看出明顯差異。推測如若將細胞量擴大3～5倍，有可能會產生統計學差異，此項內容將在以后的研究中進行。此外本次研究使用的是睪丸細胞混合懸液細胞，無法指出睪丸細胞中具體哪種細胞對環磷酰胺引起的遺傳損傷比較敏感，下一步將分離睪丸組織中的各類細胞進行單細胞凝膠電泳，以便區分哪類睪丸細胞對環磷酰胺最為敏感。

綜上，S1P對雄性小鼠的生殖毒性損傷有一定的拮抗作用，該作用可能與抗氧化有關，S1P可能活化了因環磷酰胺而降低的能量代謝酶LDH，提高精子的運動能力。S1P作用的具體機制及其與凋亡蛋白的相關性，仍有待下一步研究。

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(2016-02-01收稿，2016-04-25修回)

中文編輯： 周凌； 英文編輯： 劉華

Study on Antagonistic Effect of S1P on Toxicity Damage to Male Mice' Reproductive Cells by Cyclophosphamide

LIU Danwei1， PAN Wei1， XU Guobing2， YANG Guozhen1

(1.DepartmentofMedicalLaboratory,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang50004,Guizhou,China;2.DepartmentofMedicalLaboratory,BeijingCancerHospital,Beijing100142,China)

[Abstract]Objective: To study the antagonistic effect of S1P on toxicity damage to male mouse reproductive cells. Methods: Forty healthy male Kunming mice were randomly divided into 5 groups: normal control group( physiological saline), low S1P dose group(0.05 μg/g), middle S1P dose group(0.1 μg/g), high S1P dose(0.2 μg/g) and cyclophosphamide exposure control group.Mice in each group were given intraperitoneal injection for 5 days and killed on the 30th day after the first treatment. The serum, epididymis and testis of the mice were collected. The sperm count and the rate of sperm deformity were detected. The colorimetric method was adopted to detect LDH activity and the comet assay adopted to detect DNA damage of sperm. Results： Compared with cyclophosphamide exposure control group，sperm count increased, deformity rate decreased, LDH activity and cell DNA damage decreased in each experimental S1P group, and the differences between the two groups were statistically significant(P<0.05). Conclusion: S1P has antagonistic effect on toxicity damage to male mouse reproductive cells, can improve semen quality, activate energy metabolism enzyme LDH and resist DNA damage of sperm to some degree.

[Key words]mice; cerm cells; drug antagonism; sphingosine-1-phosphate

*[基金項目]國家自然科學基金(81560720)

[中圖分類號]R321

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)05-0515-05

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.05.005

**通信作者 E-mail:yangguozhen-kong@hotmail.com

網絡出版時間：2016-05-13網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160513.2040.024.html