血清循環(huán)DNA定量檢測在卵巢癌診斷中的應(yīng)用價(jià)值*

劉麗榮， 文春蓉， 梁　璐， 劉詠梅， 朱麗英

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院 臨床血液學(xué)教研室， 貴州 貴陽　550004； 2.貴陽市婦幼保健院 檢驗(yàn)科， 貴州 貴陽　550003)

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血清循環(huán)DNA定量檢測在卵巢癌診斷中的應(yīng)用價(jià)值*

劉麗榮1， 文春蓉2， 梁璐2， 劉詠梅1， 朱麗英1

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院 臨床血液學(xué)教研室， 貴州 貴陽550004； 2.貴陽市婦幼保健院 檢驗(yàn)科， 貴州 貴陽550003)

[摘要]目的： 探討血清循環(huán)DNA(cDNA)定量檢測在卵巢癌患者診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法： 以252例經(jīng)病理證實(shí)的上皮性卵巢癌患者為卵巢癌組，100例卵巢良性腫瘤患者作為良性對照組，健康體檢者100例作為健康對照，以微量基因組抽提試劑盒抽提3組患者血清DNA，用實(shí)時(shí)熒光定量Real-time PCR測定其含量。結(jié)果： 良性對照組和健康對照組相比，血清cDNA比值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與良性對照組和健康對照組相比，卵巢癌組血清cDNA Ct值減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；上皮性卵巢癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期血清cDNA Ct值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但Ⅳ期與Ⅰ期比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論： 定量檢測上皮性卵巢癌患者血清cDNA，有望成為臨床輔助診斷卵巢癌的新手段。

[關(guān)鍵詞]血清學(xué)； DNA； 卵巢腫瘤； 診斷技術(shù)與方法

卵巢癌是嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤之一，發(fā)病率占婦科惡性腫瘤的第3位，死亡率占各類婦科惡性腫瘤之首，對婦女生命造成了嚴(yán)重威脅。卵巢癌的確診常處于晚期，且大多數(shù)初診患者已伴盆、腹腔轉(zhuǎn)移。目前，卵巢癌的篩查診斷、療效觀察及預(yù)后判斷等，仍主要依靠腹腔鏡檢查、組織病理學(xué)檢查、血清腫瘤標(biāo)記物(如CA125、癌胚抗原等)的檢測及影像學(xué)檢查，前兩者對卵巢癌的敏感性高，但是具有創(chuàng)傷性，影像學(xué)檢查雖無創(chuàng)傷性，但卻容易造成漏診。循環(huán)DNA(circulating DNA，cDNA)是一種存在于動(dòng)植物和人體液中的無細(xì)胞狀態(tài)的胞外DNA，由細(xì)胞受外源性刺激后主動(dòng)分泌，細(xì)胞損傷或死亡后釋放產(chǎn)生[1]。研究表明，外周血cDNA一部分以游離形式存在于血清中，另一部分通過與蛋白質(zhì)結(jié)合成復(fù)合體的形式附著在血細(xì)胞表面[2]。正常人血液中也存在微量cDNA，某些病理狀態(tài)下，cDNA會(huì)有不同程度的增高，尤其腫瘤患者血液cDNA濃度明顯高于正常人[3]。目前臨床上關(guān)于抽取卵巢癌患者的血清檢測cDNA含量的報(bào)道甚少。因此血清cDNA檢測用于卵巢癌的早期診斷具有明顯的優(yōu)勢和極大的潛力。故本研究通過定量檢測卵巢癌患者血清cDNA水平，以探索檢測血清cDNA水平可否成為用于輔助卵巢癌早期診斷的新方法。

1材料與方法

1.1標(biāo)本來源

收集2013年7月～2015年2月經(jīng)臨床病理檢查確診為上皮性卵巢癌患者302例，其中Ⅰ期腫瘤57人，Ⅱ期73人，Ⅲ期94人，Ⅳ期26人；卵巢良性腫瘤患者和健康成年女性各100例血清標(biāo)本，分別于-80 ℃保存。

1.2方法

1.2.1血清cDNA的提取取600 μL血清標(biāo)本，用微量基因組DNA抽提試劑盒 (北京天根生物有限公司)，按操作說明書抽提血清DNA，用ELX800酶標(biāo)儀(Bio-tec，美國)測定各樣品吸光度值(A 260 /A 280)，計(jì)算DNA含量和純度。

1.2.2血清DNA Ct值的測定PCR引物參照文獻(xiàn)[4]設(shè)計(jì)，以看家基因GAPDH為目的基因，引物序列為5′-ATGGTGGTGAAGA-CGCCAGT-3′，5′-GCACCGT-CAAGGCTGAGAAC-3′擴(kuò)增長度為142 bp，由上海生工生物工程公司公司合成。反應(yīng)體系含定量PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，Taq DNA聚合酶(2.5 U/μL) 0.5 μL，DNA模板2 μL，加水補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)采用兩步法，條件為：95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)。用Bio-Rad CFX 96TM熒光定量PCR分析系統(tǒng)進(jìn)行定量檢測，并作熔解曲線分析，根據(jù)各自設(shè)定的臨界值的循環(huán)數(shù)(Ct)值，對cDNA的原始拷貝數(shù)進(jìn)行定量，每個(gè)血清 DNA樣品重復(fù)測定3次取均值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1GAPDH基因熔解曲線

熔解曲線顯示GAPDH的擴(kuò)增反應(yīng)具有良好的特異性(圖1)，證明實(shí)時(shí)熒光定量Real-time PCR測定檢測具有高度準(zhǔn)確度和可靠性。

圖1　GAPDH基因熔解曲線Fig.1　Melt Curve of gene GAPDH

2.2血清cDNA的Ct值

良性對照組cDNA與健康對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；卵巢癌患者各組與健康對照組、正常對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；cDNA含量水平隨卵巢癌臨床分期增加呈增高的趨勢，上皮性卵巢癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期各組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，上皮性卵巢癌Ⅳ期組與Ⅰ期組比較， cDNA含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

3討論

卵巢癌患者的治療療效以及延長生存期的主要關(guān)鍵因素取決于早期診斷，因此當(dāng)今急需建立新的早期檢測手段。近年來隨著腫瘤分子生物學(xué)的飛猛發(fā)展，人們已初步發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血清DNA濃度顯著高于正常人群，并提示體液(包括血清、血漿及腹水)DNA中高頻率遺傳學(xué)標(biāo)志變異的檢測對于監(jiān)控疾病具有一定的臨床意義[5-8]。卵巢癌是女性生殖器官常見的腫瘤之一，發(fā)病率僅次于宮頸癌和宮體癌而列居第3位，約占女性全身惡性腫瘤的4%。但因卵巢癌致死者，卻占各類婦科腫瘤的首位，對婦女生命造成嚴(yán)重威脅，對卵巢癌的早期診斷十分重要。卵巢癌的臨床分期根據(jù)1987年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)國際分期法可分為如下4期:Ⅰ期，腫瘤局限于卵巢；Ⅱ期，病變累及一側(cè)或雙側(cè)卵巢，伴盆腔轉(zhuǎn)移；Ⅲ期，腫瘤侵及一側(cè)或雙側(cè)卵巢，伴盆腔以外腹膜種植或腹膜后或腹股溝淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移;肝臟表面轉(zhuǎn)移；Ⅳ期，腫瘤侵及一側(cè)或雙側(cè)卵巢并有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，胸水存在時(shí)需找到惡性細(xì)胞，肝轉(zhuǎn)移累及肝實(shí)質(zhì)。

表1　各組血清cDNA的Ct值

(1)與健康對照組比較，P<0.05；(2)與良性對照組比較，P<0.05；(3)與上皮性卵巢癌Ⅰ期組比較，P<0.05

cDNA是一種存在于外周血，滑膜液和腦脊液中無細(xì)胞狀態(tài)的DNA，主要是由單鏈或雙鏈DNA混合組成，以DNA蛋白質(zhì)復(fù)合物或游離DNA兩種形式存在。cDNA的研究分為定性和定量兩種，定性主要檢測血清或血漿中腫瘤特異性基因改變，定量檢測則以血cDNA總量為指標(biāo)，兩者均可以反應(yīng)腫瘤的存在及其嚴(yán)重程度。對于血cDNA來源有幾種推測:(1)腫瘤細(xì)胞的壞死和凋亡釋放大量DNA；(2)循環(huán)血或微轉(zhuǎn)移灶中腫瘤細(xì)胞溶解釋放DNA；(3)腫瘤細(xì)胞自身向周圍釋放DNA；(4)腫瘤浸潤周圍正常組織細(xì)胞、組織變性釋放DNA。

本研究中，利用靈敏度極高的實(shí)時(shí)熒光定量Real-time PCR技術(shù)，定量檢測健康體檢者、卵巢良性腫瘤患者及卵巢癌患者血清cDNA。結(jié)果顯示，各期卵巢癌患者血清cDNA均明顯高于健康體檢者和卵巢良性腫瘤患者，提示血清cDNA含量檢測對卵巢癌的診斷具有重要參考價(jià)值。對cDNA含量與卵巢癌臨床分期關(guān)系的分析顯示，隨著臨床分期的增加，血清cDNA含量逐漸增高，提示卵巢癌各期cDNA含量會(huì)顯著增高，但與卵巢癌分期無明顯相關(guān)性；Ⅳ期cDNA含量顯著高于前3期，提示卵巢癌晚期cDNA含量會(huì)進(jìn)一步顯著增高。

綜上所述，隨著各種分子生物學(xué)技術(shù)快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，利用靈敏度極高的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，定量檢測卵巢癌患者血清cDNA具有簡單易操作，創(chuàng)傷小等優(yōu)點(diǎn)，對于手術(shù)后的患者無法取組織檢測化驗(yàn)，可助其實(shí)時(shí)監(jiān)測手段。作為一種微創(chuàng)而便捷的輔助手段，在卵巢癌的早期診斷、臨床分期、療效評估和預(yù)后判斷等方面具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

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(2016-01-12收稿，2016-04-25修回)

中文編輯： 劉平； 英文編輯： 劉華

Clinical Application Value of Quantitative Detection of Serum Circulating DNA in Diagnosis of Ovarian Cancer

LIU Lirong1， WEN Chunrong2， LIANG Lu2， LIU Yongmei1， ZHU Liying1

(1.DepartmentofClinicalHematology,theCollegeofClinicalLaboratoryScience，GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004，Guizhou,China；2.DepartmentofClinicalLaboratory,GuiyangWomenandChildrenHospital,Guiyang550003,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To explore application value of quantitative detection of serum circulating DNA(cDNA) in diagnosing ovarian cancer. Methods: 252 cases of pathologically confirmed patients with epithelial ovarian cancer were enrolled as ovarian cancer group, 100 cases of patients with benign ovarian cancer as benign control group, and 100 healthy people as healthy control group. Micro-genomic DNA extraction kit was adopted to extract the serum circulating DNA from the three groups and Real-time fluorescence quantitative PCR was adopted to detect the serum cDNA level. Results: There was no significantly statistical difference in level of serum cDNA between benign control group and healthy control group. There was significantly statistical difference in level of serum cDNA between ovarian cancer group and benign control group or between ovarian cancer group and healthy control group(P<0.05). In different clinical stage epithelial ovarian cancer, there was no difference in level of serum cDNA. Conclusion: Quantitative detection of serum cDNA of patients with ovarian cancer might be a novel auxiliary method for diagnosis of ovarian cancer.

[Key words]serology; DNA; ovarian cancer; diagnosis technique and method

*[基金項(xiàng)目]貴州省科學(xué)技術(shù)基金[黔科合J字(2011)2233號(hào)]

[中圖分類號(hào)]R737.31； R737.33

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2016)05-0543-03

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.05.012

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-05-13網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160513.2108.034.html