有柄石韋水提物對小鼠皮膚全層切除傷的促愈合作用*

孔祥耀， 于世博， 黎小梅， 唐　毅， 倪　穩， 陳明翠， 張金娟

(貴州醫科大學 化學與生物化學實驗室， 貴州 貴陽　550004)

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有柄石韋水提物對小鼠皮膚全層切除傷的促愈合作用*

孔祥耀， 于世博， 黎小梅， 唐毅， 倪穩， 陳明翠， 張金娟**

(貴州醫科大學 化學與生物化學實驗室， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 研究有柄石韋孢子葉(SPP)水提物對小鼠全層切除傷的影響。方法： 對75只昆明小鼠做背中線100 mm2的全層皮膚切除制作模型；隨機均分成空白組、云南白藥組和有柄石韋組，云南白藥組和有柄石韋組分別給予云南白藥粉末和有柄石韋提取物敷于傷口，連續給藥5 d；計算造模后第1～3天，第3～7天，第7～14天和第14～18天傷口縮小比例；于造模后第3、7及18天取處死小鼠，取背部皮膚組織行HE染色，觀察3組小鼠傷口皮膚肉芽組織生長情況和再上皮化程度。結果： 云南白藥組和有柄石韋組在第1～3天、第3～7天、第7～14天和第14～18天時段的傷口縮小比例均大于對照組(P<0.05)；云南白藥組在第1～3天、第3～7天和第14～18天時段的傷口縮小比例高于有柄石韋組(P<0.05)；造模后第3天，云南白藥組和有柄石韋組的肉芽組織較對照組組織規則厚實；第7天時，云南白藥組和有柄石韋組的肉芽組織厚度增加，較為緊湊，無水腫現象，成纖維細胞數量明顯增高；第18天時，3組小鼠組傷口基本愈合，但云南白藥組和有柄石韋組的傷口愈合后組織較對照組緊致，無水腫現象。結論： 有柄石韋能促進小鼠傷口愈合，作用稍弱于云南白藥。

[關鍵詞]云南白藥； 傷口愈合； 肉芽組織； 小鼠; 有柄石韋

傷口愈合是一個進化上相對保守、復雜、多細胞參與的過程，是皮膚屏障的重建過程。這個過程涉及了角質細胞、成纖維細胞、內皮細胞、巨噬細胞以及血小板等多種細胞的共同作用。這些細胞的轉移、增殖、浸潤和分化將會在炎癥反應、新組織的形成以及傷口愈合中達到頂峰[1]。有柄石韋(Pyrrosiapetiolosa)是水龍骨科石韋屬下的蕨類植物，《苗藥》中記載為黛口掌，銳貓棍，多用于治療肺癌、膀胱癌、腎炎、膀胱炎、腎結石、血尿、咳血、衄血以及哮喘。石韋屬植物主要成分為黃酮類化合物，對常見的革蘭陽性細菌如金黃色葡萄球菌及革蘭陰性菌如大腸埃希菌等均有一定的抑菌效果[2-4]。貴州民間多把此藥用于止血和促進傷口愈合，效果顯著。本文用有柄石韋孢子葉粉碎后粉末的水提物處理以小鼠皮膚全層切除傷，觀察有柄石韋對傷口愈合的作用。

1材料與方法

1.1試藥與試劑

試藥為有柄石韋，采摘于貴州當地，并于貴州醫科大學天然產物化學重點實驗室鑒定。取其孢子葉于貴州醫科大學藥學院天然藥物化學實驗室100目粉碎機粉碎，采用水提法進行有柄石韋水提物制備；試劑有95%無水酒精、碘伏、3%戊巴比妥鈉溶液、10%中性甲醛固定液及HE染液；RM2015型石蠟切片機(德國萊卡公司)，DSHZ-300型恒溫水浴箱(江蘇太倉)，BX51T-PHD-J11型顯微鏡(日本奧林巴斯)。

1.2方法

1.2.1動物分組及造模健康SPF級昆明雄性小鼠75只，體質量(20±3)g，由貴州醫科大學動物中心提供，使用許可證號為SCXK(黔)2014-001。隨機均分成對照組、云南白藥組和有柄石韋組，每組又隨機均分成第1、3、7、14及18天5個小組。造模：小鼠適應性飼養3 d后，3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，背部去毛，于每只小鼠背部脊柱正中線做100 mm2大小的全層皮膚切除(不損傷筋膜層)；術后對照組傷口不給于任何措施，云南白藥組給予云南白藥粉末，有柄石韋水提組給予有柄石韋水提物，將藥物敷于傷口上，并予清潔紗布包扎，每天給藥1次，連續給藥5 d。

1.2.2傷口縮小比例的計算造模當天設為第0天，于造模后第1、3、7、14及18天在傷口同一水平放置鋼尺以作為傷口實際面積大小的參照物，數碼相機拍攝。計算并記錄傷口縮小比例[如：]第n～(n+3)天傷口縮小比例=(第n天傷口面積-第n+3天傷口面積)/第n天傷口面積×100%〗。

1.2.3病理組織染色造模后第3、7及18天時取小鼠傷口及創緣皮膚組織，于10%中性甲醛固定24 h，常規脫水，二甲苯透明和包埋組織塊。5 μm切片，常規HE染色，光學顯微鏡下觀察組織病理HE染色切片，以愈合區域再生表皮完整程度，肉芽組織緊致程度和出現水腫為指標判斷傷口愈合質量，愈合質量較差為再生表皮不完整，肉芽組織松散，有水腫；愈合質量一般為再生表皮部分完整，肉芽組織無明顯水腫；愈合質量較好為再生表皮完整，肉芽組織緊致，無水腫[5]。

1.3統計方法

2結果

2.1傷口縮小比例

云南白藥組和有柄石韋組在第1～3天、第3～7天、第7～14天和第14～18天時段的傷口縮小比例均大于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。而云南白藥組在第1～3天、第3～7天和第14～18天時段的傷口縮小比例高于有柄石韋組，差異有統計學意義(P<0.05)，第7～14天差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1　3組皮膚全層切除傷小鼠傷口縮小比例±s)

與對照組相比，(1)P<0.01，(2)P<0.05；與云南白藥組相比，(3)P<0.01,(4)P<0.05

2.2炎癥細胞數量、肉芽組織松緊程度和上皮化程度

造模后第3天，云南白藥組和有柄石韋組的肉芽組織較規則且厚實(圖1A～B)，而對照組的肉芽組織顯得菲薄和不規則(圖1C)。造模后第7天，云南白藥組和有柄石韋組的肉芽組織繼續生長，相比造模后第3天，厚度有所增加，并且較為緊湊，無水腫現象，并且兩組成纖維細胞數量明顯增高(圖1D～E)。而對照組相對無明顯變化(圖1F)。造模后第18天，3組傷口均基本愈合，與對照組相比，云南白藥組和有柄石韋組的愈合后組織在鏡下顯得更為緊致，無水腫現象；且云南白藥組有柄石韋組已出現較多的毛囊和皮脂腺(圖1G～H)，而對照組相對較少(圖1I)。

注：A、B、C分別為第3天云南白藥組、有柄石韋組和對照組(HE，×200)；D、E、F分別為第7天云南白藥組、有柄石韋組和對照組(HE，×400)；G、H、I分別為第18天云南白藥組、有柄石韋組和對照組(HE，×200)圖1　3組皮膚全層切除傷小鼠皮膚肉芽組織Fig.1　The HE dyeing of skin granulation tissue in three groups

3討論

皮膚創傷是一種常見的健康問題，發生率較高，如處理不當會引起皮膚感染潰爛，延期愈合，尋找一種快速促進皮膚傷口愈合的藥物，是藥物研發領域最古老，也是最重要的挑戰之一。云南白藥作為我國傳統促愈良藥，可以顯著縮短傷口出血時間、凝血時間及凝血酶原時間，現已被廣泛應用于治療臨床創傷出血、消化道出血等各種出血性疾病[6]。有柄石韋是水龍骨科石韋屬下的蕨類植物，產于中國東北、華北、西北、西南和長江中下游各省區，具有重要的藥用價值，性甘、苦，微寒，歸肺、膀胱經，有利尿通淋、清熱止血的作用。《苗藥》中被叫做黛口掌、銳貓棍，全草被用于治療肺癌、膀胱癌、腎炎、膀胱炎、腎結石、血尿、咳血、衄血以及哮喘。石韋屬植物主要成分為黃酮類化合物，如山奈酚槲皮素、異槲皮素、異槲皮苷、芒果苷類等。在貴州民間，多作為刀口藥用于促進傷口愈合，且效果顯著。因此對有柄石韋進行促進皮膚愈合研究，尋找其有效成分，為尋找皮膚創傷治療藥物提供了一個有效的研究途徑。

本實驗采用小鼠皮膚全層切除傷模型研究有柄石韋水提物對傷口愈合的作用。傷口愈合過程伴隨肉芽組織增生及傷口面積縮小。肉芽組織中的成纖維細胞產生肌動蛋白，而形成肌成纖維細胞，這些細胞產生機械拉力，將創緣向中心牽拉，從而使傷口不斷收縮，因此傷口縮小比例反映了傷口愈合的速度；同一段時間內傷口縮小比例越大，說明傷口愈合的趨勢越明顯。本研究結果顯示，經云南白藥和有柄石韋治療的傷口縮小比例均大于同期的對照傷口，說明有柄石韋在促進傷口愈合上有積極作用。

上皮細胞、成纖維細胞在傷口修復過程中均有重要作用[7-8]。本研究采用HE染色評估創緣肉芽組織的生長情況，結果發現，云南白藥組和有柄石韋組的肉芽組織較對照的肉茅組織緊致、厚實。云南白藥組和有柄石韋組第18天的切片相對對照的上皮化完整，皮下已有毛囊和皮脂腺。證明有柄石韋提取物對傷口的愈合較為完全，附件功能恢復較好，與文獻報道一致[9-11]。本研究后續將考慮提取有柄石韋活性物質及進一步探明和闡述。

4參考文獻

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(2016-01-03收稿，2016-04-20修回)

中文編輯： 吳昌學； 英文編輯： 劉華

Effect of Promoting Healing ofPyrrosiapetiolosaWater Extract in Mice's Full-thickness Excision Wound

KONG Xiangyao, YU Shibo, LI Xiaomei, TANG Yi, NI Wen, CHEN Mingcui, ZHANG Jinjuan

(LaboratoryofChemistryandBiochemistry,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To observe the effect of water extract of Pyrrosia petiolosa on mice's full-thickness excision wound. Methods: 75 Kunming mice received adaptive feeding for 3 days, and 100 mm2 full thickness skin resection model was established on mice's dorsal midline. Then the mice were randomly divided into blank control group, Yunnan baiyao group and Pyrrosia petiolosa group. In Yunnan baiyao group, the powder was applied to the wound while in Pyrrosia petiolosa group the water extract of Pyrrosia petiolosa applied to the wound, and both groups received continuous administration for 5 days, once per day. Wound's area and volume reduction ratio was calculated during 1～3 days, during 3～7 days, during 7～14 days and during 14～18 days, respectively. Mice were sacrificed 3th, 7th, 18thday after model establishment, HE dyeing was conducted for dorsal skin tissue. The growth of skin granulation tissue and the degree of re-epithelialization of wound skin in mice were observed in the three groups. Results: Compared with blank control group, the wound's area and volume reduction ratio in Pyrrosia petiolosa group and Yunnan Baiyao group during 1～3 days, 3～7 days, 7～14 days and 14～18 days was significantly higher(P<0.05). Compared with Pyrrosia petiolosa group, the wound's area and volume reduction ratio in Yunnan Baiyao group during 1～3 days, 3～7 days, and 14～18 days was significantly higher(P<0.05). On the 7thday, the thickness of granulation tissue increased, skin granulation tissue was more compact. Besides, no edema existed in skin granulation tissue and the number of fibroblasts was significantly increased. On the 18thday, wound almost healed in all three groups, but the tissue after wound healing in Pyrrosia petiolosa group and Yunnan Baiyao group was more compact compared with blank control group. Also, there was no edema in tissue of Pyrrosia petiolosa group and Yunnan Baiyao group. Conclusion: Pyrrosia petiolosa can promote wound healing but its effect is poorer thanYunnan Baiyao.

[Key words]Yunnan Baiyao; wound healing; skin granulation tissue; mice; Pyrrosia petiolosa

*[基金項目]大學生創新創業基金重點項目(NO.201410660001)

[中圖分類號]R285； R29

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)05-0555-04

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.05.015

**通信作者 E-mail:826609585@qq.com

網絡出版時間：2016-05-13網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160513.2204.062.html