PI3K/Akt信號通路對氣腹預處理大鼠肝臟的保護作用*

蔣天盛， 李春來， 袁洪濤

(貴陽市第一人民醫院, 貴州 貴陽　550001)

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PI3K/Akt信號通路對氣腹預處理大鼠肝臟的保護作用*

蔣天盛， 李春來， 袁洪濤

(貴陽市第一人民醫院, 貴州 貴陽550001)

[摘要]目的： 觀察氣腹預處理后大鼠肝組織中磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路的變化。方法： 健康SD大鼠30只，隨機均分為假氣腹組、氣腹組和氣腹預處理組；氣腹組大鼠臍旁插入氣腹針并連接SN/REF氣腹機充入二氧化碳(CO2)建立氣腹模型(腹壓保持在15 mmHg，持續90 min后解除氣腹)，氣腹預處理組在建立氣腹前先進行預處理(充氣5 min，放氣5 min，重復2次)，其余同氣腹組；假氣腹組大鼠臍旁插入氣腹針但不充入CO2氣體；實驗結束后處死大鼠；取同一部位肝組織，采用Western Blot檢測肝臟中Akt、p-Akt蛋白的表達，采用TUNEL法檢測肝細胞凋亡。 結果： 與假氣腹組比較，氣腹組大鼠肝臟中Akt及p-Akt的表達顯著減少，而肝細胞凋亡率則顯著增加，差異具有統計學意義(P<0.01)；與氣腹組比較，氣腹預處理組大鼠肝臟中Akt及p-Akt的表達顯著增高，而肝細胞凋亡率則明顯較少，差異具有統計學意義(P<0.05)。 結論： PI3K/Akt信號通路可能參與了氣腹預處理對大鼠肝組織的保護作用。

[關鍵詞]模型,動物； 氣腹,人工； 預處理； 蛋白激酶B； 大鼠,Sprague-Dawley

近年來，腹腔鏡手術過程中建立二氧化碳(CO2)氣腹所導致的腹腔臟器病理生理改變及其對臟器功能的影響正日益引起關注[1]。CO2氣腹自身的壓力會造成腹腔臟器組織缺血損傷，氣腹缺血預處理對提高組織缺血耐受性的作用雖受到重視，但其保護作用的具體機制尚不清楚[2]。磷脂酰肌醇-3激酶-蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路是體內調節細胞生長、分化、凋亡的關鍵信號通路之一，PI3K可通過激活其下游效應分子Akt，抑制促凋亡蛋白Bad、Bax和caspase的形成，從而達到抑制細胞凋亡的目的[3-4]。本研究通過模擬臨床腹腔鏡手術的操作環境，通過建立CO2氣腹及氣腹預處理動物模型，初步探討CO2氣腹預處理對大鼠肝組織中PI3K/Akt信號通路的影響及其對肝組織的保護作用。

1材料與方法

1.1動物、儀器與試劑

健康成年雄性SD大鼠30只，8～12周齡體，質量220～260 g，購自貴州醫科大學實驗動物中心；SN/REF氣腹機(美國Stryker公司)；戊巴比妥鈉購自上海西塘生物科技有限公司；兔抗大鼠Akt、p-Akt抗體購自北京博奧森生物技術有限公司； PVDF膜及ECL化學發光試劑盒購自美國Millipore公司；十二烷基硫酸鈉、甘氨酸、丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷及過硫酸銨購自北京鼎國公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自南京碧云天生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1分組及模型復制30只SD大鼠隨機分為假氣腹組、氣腹組和氣腹預處理組，每組各10只。采用1%戊巴比妥鈉按40 mg/kg 體重腹腔注射麻醉后，取仰臥位固定。臍周采用75%酒精消毒滅菌，參照文獻[5]建立氣腹模型。氣腹組大鼠在臍旁插入氣腹針并連接SN/REF氣腹機充入CO2建立氣腹動物模型，腹壓維持在15 mmHg，持續90 min后解除氣腹；氣腹預處理組在建立氣腹前先進行預處理(CO2充氣5 min、腹壓維持在15 mmHg、放氣5 min，重復2次)后建立CO2氣腹，方法同氣腹組；假氣腹組僅在臍旁插入針頭但不充入CO2。手術結束后24 h(再灌注24 h后)處死大鼠，每只大鼠取相同部位肝組織于4%中性甲醛溶液中固定48 h，剩余肝組織儲存在-80 ℃低溫冰箱，統一進行Western Blot檢測。

1.2.2肝組織Akt、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)蛋白表達采用Western Blot法檢測，取0.1 g肝組織提取總蛋白，經垂直電泳分離蛋白質后，采用全濕電轉移進行轉膜，將PVDF膜置于封閉緩沖液中2 h。洗膜緩沖液洗膜3次，將PVDF膜與一抗稀釋液(Akt 1∶1 000，p-Akt 1∶500)4 ℃孵育過夜。次日用洗膜緩沖液洗膜3次，PVDF膜與二抗稀釋液(1∶3 000)在室溫下孵育1 h, 洗膜緩沖液洗膜3次。加入增強化學發光試劑，暗室中反應1 min后將PVDF膜迅速封入保鮮膜中，Kodak膠片進行顯影、定影，并用清水沖洗晾干。

1.2.3肝細胞凋亡檢測采用 TUNEL法檢測肝細胞凋亡， 嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.3統計學處理

2結果

2.1肝臟組織中Akt、p-Akt蛋白表達

各組大鼠肝臟組織中Akt、p-Akt蛋白表達如表1、圖1所示，與假氣腹組比較，氣腹組大鼠肝組織中Akt、p-Akt的表達均顯著減少(P<0.01)；與氣腹組比較，氣腹預處理組大鼠肝臟組織中Akt、p-Akt的表達均顯著增加(P<0.05)。

2.2肝細胞凋亡

TUNEL法檢測肝細胞凋亡結果如表1、圖2所示，假氣腹組大鼠肝臟內僅有少量肝細胞發生凋亡，而氣腹組大鼠肝細胞凋亡率較假氣腹組明顯增加(P<0.01)；經氣腹預處理組大鼠肝組織中細胞凋亡率較氣腹組顯著減少(P<0.05)。

表1　大鼠肝臟組織中總Akt、p-Akt水平及

(1)與假氣腹組比較，P<0.01；(2)與氣腹組比較，P<0.05

注：1 假氣腹組; 2 氣腹組; 3 氣腹預處理組圖1　3組大鼠肝臟組織中Akt、p-Akt表達(Western Blot)Fig.1　Expression of Akt and p-Akt in liver tissue of 3 groups of rats(Western Blot)

3討論

腹腔鏡手術過程中通常采用CO2氣腹技術來獲得充分的操作空間。在建立CO2氣腹的過程中，由于腹腔壓力快速增加，壓迫內臟血管，使肝動脈、門靜脈等血管阻力增加，血液灌流不足，從而導致肝臟的缺血損傷[6]；當手術結束解除氣腹后由于腹腔內壓驟降，內臟血管阻力消除，肝臟血液灌流得以恢復。因此氣腹過程實質上相當于肝臟缺血再灌注過程，其所引起的肝臟損傷已被大量研究所證實[7]。近年來有研究表明，氣腹預處理有類似缺血預處理的作用，能有效減輕腹腔鏡術中氣腹所致的肝臟損傷。Ates等[8]報道在建立大鼠CO2氣腹前，給予5 min的充氣(15 mmHg)和5 min的放氣可顯著改善術中長時間氣腹產生的缺血/再灌注損傷。PI3k/Akt信號通路中的PI3K是生長因子受體超家族中的重要成員，而其下游效應分子Akt為PKA和PKC家族成員[9]。PI3k活化后使Akt轉位到細胞膜，催化其自身的Ser124和Thr450發生磷酸化而激活；此外Akt和PDK-1同時定位在細胞膜上，PDK-1能進一步催化Akt的Ser473和Thr308發生磷酸化，從而使Akt完全活化[10]。磷酸化的Akt(p-Akt)可以傳遞抗凋亡信號到其下游的效應分子，從而發揮對抗細胞凋亡，促進細胞生長增殖的作用[11]。

假氣腹組　　　　　　　　　　　氣腹組　　　　　　　　　　　氣腹預處理組圖2　3組大鼠肝細胞凋亡(TUNEL，×200) Fig.2　Hepatocytes apoptosis of 3 groups of rats

本研究通過模擬臨床腹腔鏡手術的操作環境，建立CO2氣腹及氣腹預處理動物模型，觀察各組大鼠肝臟組織中總Akt及p-Akt的表達情況。結果表明，氣腹組大鼠肝組織中總Akt及p-Akt的表達較假氣腹組顯著減少，同時肝組織內細胞凋亡率顯著增加，提示PI3K/Akt信號通路的抑制可能參與了CO2充氣和放氣造成的肝組織缺血/再灌注損傷。而氣腹預處理組大鼠肝組織中總Akt及p-Akt的表達較氣腹組明顯增多，同時肝組織內細胞凋亡率較氣腹組有所減少，這充分表明氣腹預處理能通過激活PI3K/Akt信號通路減少肝細胞凋亡來發揮減輕肝組織缺血-再灌注損傷的作用。

4參考文獻

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(2016-01-10收稿，2016-04-22修回)

中文編輯： 吳昌學； 英文編輯： 趙毅

Protective Effect of PI3K/Akt Signaling Pathway on Liver of Pneumoperitoneum Preconditioning Rats

JIANG Tiansheng, LI Chunlai, YUAN Hongtao

(TheFirstPeople'sHospitalofGuiyang,Guiyang550001,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To observe the change of PI3K/Akt signaling pathway in liver tissue of pneumoperitoneum preconditioning rats. Methods: 30 healthy SD rats were divided into sham pneumoperitoneum group, pneumoperitoneum group and pneumoperitoneum preconditioning group randomly, 10 rats in each group. Inserting the veress beside the navel of rats and connecting SN/REF pneumoperitoneum machine to insufflate CO2 for 90 minutes to establish the pneumoperitoneum model, abdominal pressure maintained at 15 mmHg. The pneumoperitoneum preconditioning group was subjected to 5 min of insufflation and 5 min of deflation, repeat for 2 times, then following the same practice as pneumoperitoneum group. The rats of sham pneumoperitoneum group were inserted needles but not filling CO2. Changes of PI3K/Akt signaling pathway were detected by western blot. The apoptosis of hepatocytes was detected by TUNEL. Results: Comparing with sham pneumoperitoneum group, the expression of total Akt and p-Akt of pneumoperitoneum group were significantly decreased(P<0.01), while the apoptosis of hepatocytes was increased; comparing with pneumoperitoneum group, the expression of total Akt and p-Akt of pneumoperitoneum preconditioning group were significantly increased(P<0.05), while the apoptosis of hepatocytes was decreased. Conclusion: PI3K/Akt signaling pathway may be involved in the protective effects of pneumoperitoneum preconditioning on liver tissue of rats.

[Key words]model,animal; pneumoperitoneum,artificial; preconditioning; protein kinase B; rats,Sprague-Dawley

*[基金項目]貴陽市衛生局科學技術計劃項目[(2014)筑衛科技合同字第2號]

[中圖分類號]R657.3

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)05-0564-03

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.05.017

網絡出版時間：2016-05-13網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160513.2115.040.html