高效液相色譜法測定不同產地蝦仁中的甲醛殘留

龐維榮，張　強，王　瑞（山西中醫學院，山西太原030024）

?

高效液相色譜法測定不同產地蝦仁中的甲醛殘留

龐維榮，張強，王瑞
（山西中醫學院，山西太原030024）

摘要目的：采用高效液相色譜法建立不同產地蝦仁中甲醛殘留含量的測定方法，為評價蝦仁的質量提供依據。方法：以2，4-二硝基苯肼（2，4-DNPH）為衍生試劑，在冰乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（pH=5）中反應，使甲醛轉化為相應穩定的甲醛-2，4-二硝基苯腙，利用二極管陣列檢測器進行測定。結果：甲醛峰面積與濃度在2 μg/mL～20 μg/mL范圍內呈良好的線性關系，相關系數r= 0.999 2；回收率為71.12%～73.50%，方法檢出限為5 mg/kg；相對標準偏差RSD小于5.7%。結論：該方法的精密度、穩定性和重復性均良好，可用于蝦仁中甲醛的限量檢查。

關鍵詞蝦仁；甲醛；含量測定；高效液相色譜法

蝦仁營養豐富，且肉質松軟，易消化，對身體虛弱以及病后需要調養的人是極好的養生保健食物。然而隨著人們對蝦需求量逐年增大，有些漁民和不法商販由于經濟利益的驅使，經常向浸泡液中加入非食品用的添加劑甲醛，其主要目的是為了保持蝦的新鮮，延長保質期，改善外觀，增加口感和起到定型的作用［1］。甲醛為具有刺激性臭味的無色可燃性液體，易溶于水，具有十分活潑的化學與生物學活性，對人體的毒性主要表現為嗅覺異常、刺激、致敏、免疫毒性、神經毒性、腦損傷等，長期接觸將導致人體基因突變引發許多器官惡性腫瘤的形成［1-7］。國際癌癥研究機構（IARC）已于2004年將其列入第1類致癌物。本研究建立了高效液相色譜測定蝦仁中甲醛含量的方法，本方法準確可靠、快速、穩定，具有較好的應用、普及和推廣價值。

1儀器與試藥

高效液相色譜儀（Waters 515 2996檢測器，美國Waters公司）、FA/JA 1004型萬分之一電子天平（上海天平儀器廠）、HH-2恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市環宇科學儀器廠）、渦旋混合器（賽智科技杭州有限公司）、HC-2518高速離心機（北京東南儀誠實驗室設備有限公司）、10 mm×150 mm具塞玻璃層析柱、25 μL微量進樣器、15 mL具塞比色管、0.45 μm微孔濾膜。

甲醇為色譜純，二氯甲烷、2，4-二硝基苯肼、無水硫酸鈉均為分析純，水為樂百氏純凈水，甲醛標準溶液（100 mg/L購自國家標準物質中心）。蝦仁藥材來源如表1所示。

表1　蝦仁來源

2方法與結果

2.1溶液的制備

2.1.1 2，4-二硝基苯肼溶液的制備稱取100 mg 2，4-二硝基苯肼，精密稱定，溶解于24 mL濃鹽酸中，加水定容至100 mL，即得［8］。

2.1.2甲醛儲備液的制備精密移取甲醛（100 mg/L）標準溶液5 mL至25 mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，配制成每1 mL含甲醛20 μg的標準儲備液。

2.1.3甲醛對照品溶液的制備分別取甲醛標準儲備液0 mL、0.1 mL、0.25 mL、0.5 mL、0.75 mL、1.0 mL于15 mL具塞比色管中，加蒸餾水至1 mL，加0.2 mL 2，4-二硝基苯肼溶液，置60℃水浴15 min，然后在流水中快速冷卻，加入2 mL二氯甲烷，渦旋混合器振蕩萃取1 min，3 000 r/min離心2 min，取上清再用二氯甲烷萃取2次，每次1 mL，合并3次萃取的下層黃色溶液，將萃取液經無水硫酸鈉脫水，60℃水浴蒸干，放冷，用甲醇定容至1 mL，經0.45 μm微孔濾膜過濾，即得空白溶液和濃度分別為2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL的甲醛與2，4-二硝基苯肼衍生物溶液。

2.1.4供試品溶液的制備取蝦仁藥材粉末（過四號篩）1g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，加入10 mL蒸餾水，置于40℃恒溫振蕩器中，40 r/min振搖提取2 h，3 500 r/min離心3 min，取上清2 mL于15 mL具塞比色管中，照“2.1.3”項下，自“加0.2 mL 2，4-二硝基苯肼溶液”起，依法操作，即得供試品溶液［9］。

2.2色譜條件

按《中華人民共和國水產行業標準》SCT 3025-2006水產品中甲醛測定的高效液相色譜法進行測定。色譜柱：DiamonsiL RP-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為甲醇∶水（60∶40），流速：0.5 mL/min，柱溫：室溫，檢測器：二極管陣列檢測器，檢測波長：338 nm，進樣量：20 μL。

2.3線性范圍考察

分別精密吸取“2.1.3”項下的各對照品溶液20 μL注入高效液相色譜儀，測定其峰面積，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。甲醛的回歸方程為y=338 620x+69 015，r=0.999 2，線性范圍為2 μg/mL～20 μg/mL。

2.4精密度實驗

照高效液相色譜法（附錄VID）實驗，精密吸取“2.1.3”項下10 μg/mL對照品溶液20 μL，注入高效液相色譜儀中，按上述色譜條件，重復測定6次，計算甲醛峰面積積分值的RSD值為2.3%，結果表明儀器精密度良好。

2.5重復性實驗

稱取北極蝦（20111009）藥材粉末（過四號篩）6份，每份1g，精密稱定，照“2.1.4”項下方法制備，得北極蝦藥材的樣品溶液1、2、3、4、5、6。分別精密吸取上述溶液20 μL，依法測定，計算甲醛含量的RSD值為2.9%，結果表明方法的重復性良好。

2.6加樣回收率實驗

稱取已知含量的北極蝦（20111009）藥材粉末（過4號篩）9份，每份1g，精密稱定，每3份分別加入100 mg/L的甲醛對照品溶液50 μL、100 μL、200 μL，照“2.1.4”項下方法制備，得加樣回收率實驗的樣品溶液1、2、3、4、5、6、7、8、9。

分別精密吸取上述溶液20 μL，注入高效液相色譜儀中，按上述的色譜條件進行測定，計算甲醛的加樣回收率和RSD值，結果如表2所示。甲醛加樣回收率為71.12%～73.50%，RSD值為3.9%～5.7%，結果表明方法的準確度良好。

表2　加樣回收率實驗　（n=9）

2.7檢出限

精密量取“2.1.2”項下的甲醛對照品溶液適量，照“2.1.4”項下方法制備，調節對照品加入量，進樣并記錄色譜圖，在S/N＞3時，甲醛的檢出限為5 mg/kg。

2.8樣品含量測定

按照上述方法，分別測定中國對蝦樣品3批、日本對蝦樣品3批、凡納濱對蝦樣品2批、鷹爪蝦樣品1批、脊尾白蝦樣品2批、北極蝦樣品1批，色譜圖如圖1所示，結果見表3。

3討論

《中華人民共和國農業行業標準》（NY/T840-2004）“蝦的理化要求”項下規定，甲醛不得超過10.0 mg/kg，即百萬分之十。12批蝦仁有9批（中國對蝦20111008、中國對蝦20111025、中國對蝦20111111、日本對蝦20111120、凡納濱對蝦20111008、凡納濱對蝦20111120、鷹爪蝦20111008、脊尾白蝦20111008、北極蝦20111009）甲醛測定結果超過了百萬分之十（10 ppm），因此應將甲醛的含量限度納入蝦仁的質量標準中。

圖1　甲醛HPLC色譜圖

表3　不同批次蝦仁樣品中甲醛的含量

本研究采用回旋振蕩提取、2，4-二硝基苯肼衍生化、HPLC法測定蝦仁中的甲醛含量，取得滿意結果，重現性和穩定性較好，為大批量蝦仁中甲醛的測定及質量控制提供了一種快速、高效、可靠的方法。

參考文獻

［1］張崇華，閆海，劉曉慧.甲醛毒性的研討［J］.醫學創新研究，2006，3（5）：62-63.

［2］林妃妃，陳嬌桂.某海鮮市場海產品甲醛含量的抽樣調查［J］.大眾科技，2011（5）：114-115.

［3］李一喬，陳浩浩，尹一飛，等.甲醛吸入對大鼠嗅球和海馬神經細胞的影響［J］.浙江大學學報：醫學版，2010，39（3）：272-278.

［4］朱桂珍.甲醛中毒的診斷與治療［J］.中毒與急救，2006，4（1）：57-60.

［5］梁瑞峰，袁福勝，白劍英，等.甲醛對小鼠的免疫毒性及氧化損傷的研究［J］.環境與健康雜志，2007，24（6）：396-398.

［6］鄒志飛，吳赤蓬，鄭立新，等.甲醛的毒物興奮效應及其所致損害的實驗研究［J］.職業與健康，2012，26（7）：721-725.

［7］童志前，韓嬋帥，苗君葉，等.內源性甲醛異常蓄積與記憶衰退［J］.生物化學與生物物理進展，2011，38（6）：575-579.

［8］國家水產品質量監督檢驗中心.水產品中甲醛的測定［M］.北京：中國農業出版社，2006.

［9］中華人民共和國浙江出入境檢驗局和中華人民共和國黑龍江出入境檢驗局.進出口食品中甲醛含量測定-液相色譜法［M］.北京：中國標準出版社，2005：1 547-2 005.

（編輯：梁葆朱）

Conclusion：The method hasgood precision degree，stability and reproducibility and could be used for limited examination of formaldehyde in the shrimp.

Determination of formaldehyde in shrimp from different areas by HPLC

Pang Weirong，Zhang Qiang，Wang Rui
（Shanxi College of TCM，Taiyuan Shanxi 030024）

AbstractObjective：To develop a method for determinating the content of formaldehyde in shrimp from different areas，and provide a basis for evaluating the quality of shrimp.Methods：2，4 dinitrophenyl hydrazine（2，4-DNPH）was used as derivative reagent in this study，and reaction was carried out inglacial acetic acid-sodium acetate buffer solution（pH=5）so that formaldehyde could converted to formaldehyde-2，4 dinitrophenyl hydrazone.Content of formaldehyde was determinated by diode array detector.Rusults：Thegood linear range of formaldehyde was 2 μg/mL～20 μg/mL（r=0.999 2），the recovery rate was 71.12%～73.50%，the detection limit was 5 mg/kg，and the relative standard deviation（RSD）was less than 5.7%.

Key wordsshrimp；formaldehyde；content determination；HPLC

中圖分類號：R284.1

文獻標識碼：A

文章編號：1671-0258（2016）02-0026-03

［基金項目］山西中醫學院博士基金資助項目

［作者簡介］龐維榮，E-mail：wrgreentea@163.com