風(fēng)濕寧膠囊的質(zhì)量控制研究

陳　飛，段秀俊，金　龍，薛慧清，史靜超，周　然（山西中醫(yī)學(xué)院，山西太原030024）

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風(fēng)濕寧膠囊的質(zhì)量控制研究

陳飛，段秀俊，金龍，薛慧清，史靜超，周然
（山西中醫(yī)學(xué)院，山西太原030024）

摘要目的：建立風(fēng)濕寧膠囊的鑒別方法及含量測定方法。方法：鑒別采用薄層色譜法，含量測定采用高效液相色譜法。結(jié)果：獨活、青風(fēng)藤、血竭與肉桂的薄層鑒別圖譜中，斑點清晰，陰性無干擾；血竭及青風(fēng)藤的HPLC測定方法，血竭素線性范圍0.116 μg～0.581 μg，Y=3×106X-13 854（r=0.999 6），平均回收率為100.86%，RSD為2.14%（n=6）；青藤堿線性范圍0.2 μg～1.6 μg，Y=18.13X-0.005 5（r=0.999 1），平均回收率為100.96%，RSD為2.34%（n=6）。結(jié)論：鑒別及含量測定方法專屬性強，重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高，可用于風(fēng)濕寧膠囊的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞風(fēng)濕寧膠囊；薄層鑒別；HPLC；血竭素；青藤堿

風(fēng)濕寧膠囊由青風(fēng)藤、獨活、威靈仙、防風(fēng)、血竭、肉桂等17味中藥組成，具有祛風(fēng)散寒、除濕通絡(luò)、活血止痛的功能，臨床用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎、痛風(fēng)性和風(fēng)濕性及退行性關(guān)節(jié)炎等，為國家科技部重大專項重大新藥創(chuàng)制項目。本實驗主要進行了風(fēng)濕寧膠囊的質(zhì)量控制研究，包括鑒別與含量測定，為其開發(fā)應(yīng)用奠定良好的基礎(chǔ)，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1實驗材料

1.1儀器

Hitachi高效液相色譜儀（包括5110四元泵、5210自動進樣器、5310柱溫箱、5430二極管陣列檢測器D-2000 Elite色譜工作站，日立公司），Bs2245電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限責(zé)任公司），KQ-500超聲波清洗儀（江蘇省昆山市淀山湖鎮(zhèn)）。

1.2試藥

風(fēng)濕寧膠囊由仁源堂制藥有限公司提供，3批，批號分別為110324、110325、110326。血竭素高氯酸鹽對照品（批號110811-200704）、青藤堿對照品（批號0774-200206）、獨活對照藥材（批號120940-201010）、威靈仙對照藥材（批號121189-200101）、川牛膝對照藥材（批號121065-201004）、血竭對照藥材（批號120906-200609）、肉桂對照藥材（批號121363-200401），均購于中國藥品生物制品檢定所。薄層色譜用硅膠G及硅膠GF254預(yù)制板均購自青島海洋化工廠。高效液相用乙腈、甲醇為色譜純，水為純凈水，其余所用試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1薄層鑒別

2.1.1獨活［1］取本品內(nèi)容物3g，加甲醇10 mL，超聲處理15 min，濾過，取濾液為供試品溶液。另取獨活對照藥材1g及獨活陰性膠囊內(nèi)容物3g，同法制備對照藥材溶液及陰性對照溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2010版一部，附錄ⅥB）實驗，吸取上述溶液各10 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以石油醚（60℃～90℃）-乙酸乙酯（7∶3）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性無干擾（見圖1-Ⅰ）。

2.1.2青風(fēng)藤［2］取本品內(nèi)容物4g，加水20 mL，離心，取上清液，加濃氨試液調(diào)至堿性，用乙醚振搖提取3次，每次20 mL，合并乙醚液，蒸干，殘渣加甲醇0.5 mL使溶解，作為供試品溶液。另取青風(fēng)藤陰性膠囊內(nèi)容物4g，同法制備陰性對照溶液。再取青藤堿對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2010版一部，附錄ⅥB）實驗，吸取上述溶液各10μL，分別點于同一塊硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-二乙胺（2∶4∶2∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以改良碘化鉍鉀試液。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性無干擾（見圖1-Ⅱ）。

2.1.3血竭［3］取本品內(nèi)容物1g，加乙醚10 mL，密塞，超聲處理10 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加氯仿1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取血竭對照藥材0.1g、血竭陰性膠囊內(nèi)容物1g同法制成對照藥材溶液及陰性對照溶液。再取血竭素高氯酸鹽對照品，加甲醇制成每1 mL含0.05 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2010版一部，附錄ⅥB）實驗，吸取上述溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇（90∶7∶3）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性無干擾（見圖1-Ⅲ）。

2.1.4肉桂［4］取本品內(nèi)容物2g，加乙醚10 mL，冷浸30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加氯仿1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取肉桂對照藥材1g及肉桂陰性膠囊內(nèi)容物2g，同法制備對照藥材溶液及陰性對照溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2010版一部，附錄ⅥB）試驗，吸取上述溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60℃～90℃）-乙酸乙酯（17∶3）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯現(xiàn)相同顏色的熒光斑點，陰性無干擾（見圖1-Ⅳ）。

圖1　風(fēng)濕寧膠囊薄層色譜圖

2.2血竭素及青藤堿的含量測定［6-8］

2.2.1溶液的制備

2.2.1.1對照品溶液的制備取在五氧化二磷中干燥24 h的血竭素高氯酸鹽對照品適量，精密稱定，加3%的磷酸甲醇溶液制成每1 mL含0.04 mg的溶液，搖勻，即得（每1 mL中含血竭素29 μg）。取在五氧化二磷中干燥24 h的青藤堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，搖勻，即得。

2.2.1.2供試品溶液的制備取膠囊內(nèi)容物約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入3%的磷酸甲醇溶液10 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率200 W，頻率40 kHz）10 min，放冷，再稱定重量，用3%的磷酸甲醇溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為測定血竭素的供試品溶液。

取膠囊內(nèi)容物約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%的乙醇20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率200 W，頻率40 kHz）20 min，放冷，再稱定重量，用70%的乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為測定青藤堿的供試品溶液。

2.2.1.3陰性對照溶液的制備分別取缺青風(fēng)藤及血竭的空白風(fēng)濕寧膠囊，按2.2.1.2項下方法制備各自的陰性對照溶液。

2.2.2色譜條件

2.2.2.1血竭Diamonsil C18色譜柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）；柱溫：40℃；流動相：乙腈-0.05 moL/L磷酸二氫鈉溶液（28∶72）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：456 nm。

2.2.2.2青藤堿Hypersil BDS C18色譜柱（4.6 mm× 200 mm；5 μm）；柱溫：30℃；流動相：甲醇-磷酸鹽緩沖液（0.05 moL/L磷酸二氫鈉，含0.8%的二乙胺）（35∶65）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：268 nm。

2.2.3專屬性實驗分別精密吸取上述青風(fēng)藤、血竭的供試品溶液、對照品溶液及陰性對照溶液各10 μL注入液相色譜儀，按2.2.2項下色譜條件測定，結(jié)果表明血竭素高氯酸鹽與其他成分分離度良好（見圖2），青藤堿與其他成分分離度亦良好（見圖3）。

圖2　風(fēng)濕寧膠囊血竭素含量測定HPLC圖

2.2.4方法學(xué)驗證

2.2.4.1線性關(guān)系考察制備每1 mL含0.2 mg（相當(dāng)于血竭素0.145 mg/mL）的血竭素高氯酸鹽對照品儲備液，精密吸取儲備液0.4 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL分別置于6個5 mL容量瓶中，各加3%的磷酸甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。制備每1 mL含0.5 mg的青藤堿對照品儲備液，精密吸取0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、1 mL、1.2 mL、1.6 mL分別置于6個5 mL容量瓶中，各加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。分別精密吸取上述各對照品溶液10 μL注入液相色譜儀，按2.2.2項下色譜條件測定，記錄色譜圖。以峰面積為縱坐標(biāo)Y，對照品進樣量（μg）為橫坐標(biāo)X，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進行線性回歸。得血竭素、青藤堿的回歸方程分別為Y=3×106X-13 854（r=0.999 6）和Y=18.13X-0.005 5 （r=0.999 1），結(jié)果表明血竭素、青藤堿進樣量分別在0.116 μg～0.581 μg，0.2 μg～1.6 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性。

圖3　風(fēng)濕寧膠囊青風(fēng)藤含量測定HPLC圖

2.2.4.2精密度實驗取2.2.1.1項下各對照品溶液，分別連續(xù)進樣6次，按2.2.2項下色譜條件測定，血竭素高氯酸鹽及青藤堿峰面積值的RSD分別為1.65%，1.16%，表明方法精密度良好。

2.2.4.3穩(wěn)定性實驗取風(fēng)濕寧膠囊（批號110324批），取2.2.1.2項下各供試品溶液，分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h各精密吸取10 μL注入液相色譜儀，按2.2.2項下色譜條件測定。結(jié)果血竭素高氯酸鹽及青藤堿峰面積值的RSD分別為1.02%，2.07%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4.4重復(fù)性實驗取風(fēng)濕寧膠囊（批號110324）各6份，分別按2.2.1.2項下方法制備相應(yīng)的供試品溶液，按2.2.2項下相應(yīng)色譜條件測定。結(jié)果血竭素高氯酸鹽及青藤堿的含量分別為0.16 mg/g，3.70 mg/g，RSD分別為0.89%，2.17%，表明各方法重復(fù)性均良好。

2.2.4.5加樣回收試驗①血竭素：取已知含量風(fēng)濕寧膠囊（批號110324）6份，每份約0.5g，精密稱定，分別精密加入0.08 mg的血竭素對照品，按

2.2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.2.2項下色譜條件測定，計算回收率，結(jié)果見表1。②青藤堿：取已知含量風(fēng)濕寧膠囊（批號110324）6份，每份約0.3g，精密稱定，分別精密加入1.05 mg的青藤堿對照品，按2.2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.2.2項下色譜條件測定，計算回收率，結(jié)果見表1。

表1　血竭素和青藤堿加樣回收實驗

2.2.5樣品測定取3批風(fēng)濕寧膠囊，按2.2.1.2項下方法分別制備相應(yīng)供試品溶液，按2.2.2項下相應(yīng)色譜條件測定，計算各樣品中血竭素和青藤堿的含量，結(jié)果見表2。

3討論

表2　風(fēng)濕寧膠囊中血竭素、青藤堿含量　（n=2）

實驗曾對威靈仙、川牛膝也進行了薄層鑒別研究，但川牛膝陰性干擾明顯，威靈仙紫外燈下觀察陰性干擾明顯，噴顯色劑后成藥檢出不明顯，故未列入薄層鑒別項。

風(fēng)濕寧膠囊原粉入藥的只有血竭，采用藥典方法對血竭進行薄層鑒別，斑點接近溶劑前沿，Rf值過大。經(jīng)摸索，展開劑中加適量的乙酸乙酯，提高極性，可使血竭素高氯酸鹽的斑點Rf值比較適宜，且斑點集中而清晰。

血竭素高氯酸鹽易分解，因此配制好的血竭素高氯酸鹽溶液應(yīng)立即避光密封保存。2010年版中國藥典一部測定血竭藥材中血竭素的含量時，供試品溶液的制備采用的是振搖3 min的提取方法，文獻報道多用超聲提取，但提取時間不一。由于血竭素穩(wěn)定性較差，為了既不破壞血竭素，又保證提取效果，實驗對提取方法進行了考察，比較了冷浸3 min、超聲5 min、10 min、20 min、30 min對血竭素提取效果的影響，結(jié)果超聲提取比冷浸效果要好，且超聲時間以10 mim為宜。

青藤堿含量測定制備供試品溶液，因成藥是通過水煎醇沉處理的，加70%的乙醇稍微超聲即可很好地溶解。實驗考察了超聲時間對測定結(jié)果的影響，結(jié)果超聲10 min、20 min、30 min對青藤堿的提取效果影響不明顯，為節(jié)省時間，將超聲提取時間定為10 min。

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（編輯：梁葆朱）

Methods：TLC was used for identification，HPLC was used for determination.Results：Spots of Radix Angelicae，Caulis Sinomenii seu Diploclisiae，Resina Draconis and Casssia Barktree were clear，and the blank test didn′t show interference.Linear range of dracorhodin was 0.116 μg～0.581 μg，the regression equation was Y=3×106X-13 854（r=0.999 6），the average recovery rate was 100.86%，and RSD was 2.14%（n=6）；the linear range of sinomenine was 0.2 μg～1.6 μg，the regression equation was Y=18.13X-0.005 5（r=0.999 1），the average recovery rate was 100.96%，and RSD was 2.34%（n= 6）.Conclusion：The methods for identification and content determination havegood specificity，repeatability and accuracy and could be used to control the quality of Fengshining capsules.

Study of the quality control for Fengshining capsules

Chen Fei，Duan Xiujun，Jin Long，Xue Huiqing，Shi Jingchao，Zhou Ran
（Shanxi College of TCM，Taiyuan Shanxi 030024）

AbstractObjective：To establish the methods for identification and content determination of Fengshining capsules.

Key wordsFengshining capsules；TLC identification；HPLC；dracorhodin；sinomenine

中圖分類號：R284

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1671-0258（2016）02-0035-04

［基金項目］國家科技重大專項重大新藥創(chuàng)制項目（2010ZX09102-210）；山西省科技產(chǎn)業(yè)化環(huán)境建設(shè)項目（2012061014-3）

［作者簡介］陳飛，碩士在讀，E-mail：dxjzhyxy@163.com

［通訊作者］段秀俊，副教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail：dxjzhyxy@163.com