RIPK3過表達對mTOR及其相關基因轉錄的調控作用

張國祿，程世翔，徐忠偉，衣泰龍，涂 悅*，張 賽

(1.武警后勤學院附屬醫院腦科醫院，天津市神經創傷修復重點實驗室，武警部隊腦創傷與神經疾病研究所，天津 300162；2.武警后勤學院中心實驗室 天津 300309)

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·論 著·

RIPK3過表達對mTOR及其相關基因轉錄的調控作用

張國祿1，程世翔1，徐忠偉2，衣泰龍1，涂 悅1*，張 賽1

(1.武警后勤學院附屬醫院腦科醫院，天津市神經創傷修復重點實驗室，武警部隊腦創傷與神經疾病研究所，天津 300162；2.武警后勤學院中心實驗室 天津 300309)

目的探索受體相互作用蛋白激酶3(receptor-interacting protein kinase 3，RIPK3)的下游信號通路。方法向實驗組SH-SY5Y細胞內轉染pCMV6-RIPK3 質粒上調細胞內RIPK3的表達水平，對照組細胞轉染相應的空載質粒。通過Western blot檢測細胞內RIPK3的表達水平。3-(4，5-二甲基噻唑)[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)，MTT]實驗獲得2組細胞增殖曲線確定外源性RIPK3在細胞內具有的生物學活性。通過RNAseq檢測2組細胞基因轉錄差異，并在生物通路分析(ingenuity pathway analysis，IPA)數據庫中進行數據分析，獲得RIPK3的下游信號通路及其中的關鍵分子哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)。采用微滴式數字化PCR(droplet digital PCR，ddPCR)對mTOR轉錄水平的差異進行驗證。結果質粒DNA整合到細胞基因組內，Western blot 提示外源性RIPK3在實驗組細胞內穩定表達，MTT結果證明其在細胞內能夠抑制細胞增殖。RNAseq及IPA分析結果提示過表達RIPK3能夠導致mTOR轉錄水平發生上調，并對其下游的基因，包括固醇反應結合蛋白(sterol-response binding proteins，SREBPs)、p70核糖體S6蛋白激酶(p70 ribosomal S6 protein kinases，S6K)、真核生物起始因子4E結合蛋白(eukaryotic initiation factor 4E-binding proteins，4E-BPs)和ULK(unc-51-like kinase)激酶復合體的轉錄具有明顯的調節作用。ddPCR實驗結果中mTOR表達改變趨勢與RNAseq基本一致。結論 RIPK3能夠調控mTOR及其下游信號通路中SREBPs、S6K、4E-BPs和ULK基因轉錄水平，進而在神經系統生長發育和疾病進展中發揮重要作用。

神經母細胞瘤；受體相互作用蛋白激酶-3；基因表達調控

受體相互作用蛋白激酶3(receptor-interacting protein kinase 3，RIPK3)是腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)介導程序性壞死(necroptosis)信號通路中的關鍵分子，在TNF-α的作用下能夠被受體相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting protein kinase 1，RIPK1)激活，進而發揮出典型的絲/蘇氨酸蛋白激酶活性。近期的研究提示：RIPK3在凋亡、程序性壞死等細胞可控性細胞死亡過程中發揮著重要的作用[1]，是潛在的調節甚至逆轉細胞死亡進程的靶點。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，能夠調節細胞新陳代謝并改善細胞在不同環境下的生長狀態。mTOR信號通路的下調出現在多種疾病中[2]，包括神經元軸突修復、神經退行性疾病和癌癥。本研究將RIPK3與mTOR信號通路聯系起來，擴展了RIPK3在神經系統中發揮生物活性的新途徑，報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人神經母細胞瘤細胞系SH-SY5Y(ATCC公司)。

1.1.2 試劑 DMEM/F12細胞培養基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(Gibco公司)，pCMV6-AC-GFP質粒(OriGene公司)，質粒小提中量試劑盒(TIANGEN公司)，Lipofectamine 3000(Life公司)，兔抗GAPDH抗體、小鼠抗RIPK3抗體(Abcam公司)，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔、羊抗鼠二抗(KPL公司)，G418、TRIzol試劑(Invitrogen公司)，逆轉錄試劑盒(CWBIO公司)，EvaGreen Supermix(Bio-Rad公司)。

1.1.3 儀器設備 Thermo Scientific CO2培養箱(Thermo公司)，倒置顯微鏡及激光共聚焦顯微鏡(Leica公司)，Multiskan FC酶標儀(Thermo公司)，基礎型電泳電源，小型垂直電泳系統，半干轉印系統，QX200微滴式數字PCR系統(Bio-Rad公司)，AI600凝膠成像系統(GE公司)。

1.2 方法步驟

1.2.1 細胞培養 DMEN/F12培養基中加入10% FBS構成完全培養基用于常規培養，0.25%胰酶、0.53 mmol/L乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)溶液消化為單細胞懸液進行傳代，于細胞培養箱中培養，培養條件為95%空氣與5%CO2混合氣體，溫度設定為37 ℃,凍存液為含5%二甲基亞砜的完全培養基，凍存細胞保存于液氮。

1.2.2 細胞轉染 合成空載及攜帶有RIPK3-GFP基因系列的pCMV6質粒，轉化DH5-α感受態大腸桿菌，在含有氨芐青霉素的LB平板培養基和液體培養基中分別進行篩選和擴增，按照試劑盒所附說明書提取質粒DNA，定量后保存于-80 ℃。按照標準步驟采用Lipofectamine 3000試劑轉染，SH-SY5Y細胞接觸密度約為50%并常規培養48 h，在激光共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(green fluore scent protein,GFP)表達情況，GFP陽性細胞以G418濃度為1 000 mg/L的完全培養基進行篩選以獲取穩定轉染的SH-SY5Y細胞，傳代2次后G418濃度減為800 mg/L維持培養，并凍存細胞備用。

1.2.3 Western blot 取對數生長期的細胞，蛋白裂解液(radio immunopreciptation assay,RIPA)裂解細胞并進行超聲裂解，12 000 g×10 min離心后取上清，BCA試劑盒定量后按比例加入loading buffer 100 ℃×10 min變性。垂直凝膠電泳每泳道上樣量為25 μg，80 V恒壓電泳，將分離后的蛋白半干轉膜法轉移到硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉液封閉2 h，一抗孵育過夜，次日洗膜并加二抗，于室溫孵育2 h。洗膜后滴加ECL化學發光劑，在AI600凝膠成像系統中成像。

1.2.4 3-(4，5-二甲基噻唑)[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)，MTT]實驗 將細胞消化成單細胞懸液稀釋至5×104/mL，在預定時間點接種至96孔板，設3組重復。常規培養，按實驗要求培養至相應時間點，向培養孔中加入MTT并孵育4 h，去上清酶標儀檢測獲得490 nm波長處光吸收值。實驗重復3次。對數據進行統計學分析。

1.2.5 基因轉錄水平差異檢測及數據分析 TRIzol法提取細胞總RNA，利用攜帶polyT黏性末端的磁珠富集mRNA并進行質控檢測。將富集獲得的mRNA打斷為短片段，并逆轉錄為互補DNA(complementary DNA，cDNA)，對其進行修復及適當修飾并進行篩選，篩選后通過PCR建立cDNA文庫。對cDNA文庫進行檢測確認其符合后續實驗要求，上機測序。實驗結果在生物通路分析(ingenuity pathusay analysis,IPA)數據庫中進行數據分析，以GAPDH為內參計算基因相對轉錄水平=(目的基因RPKM/GAPDH基因RPKM)×100%。

1.2.6 微滴式數字化PCR(ddPCR) 細胞總RNA逆轉錄為cDNA，將MILIQ 水、cDNA、引物及ddPCR EvaGreen Supermix按要求配比，構成的20 μL反應體系并微滴化。按照95 ℃×10 min，循環條件為95 ℃×30 s，60 ℃×1 min，72 ℃×1.5 min，循環次數為40次進行擴增。在完成反應后90 ℃維持5 min以穩定微滴。以QX200微滴讀取儀進行信號采集，并對實驗數據進行分析[QuantaSoft(1.3.2.0)軟件]獲得基因拷貝數，以GAPDH為內參進行校正后計算基因相對轉錄水平=(實驗組轉錄水平/對照組轉錄水平)×100%。引物序列見表1。

表1 ddPCR 引物序列

2 結果

2.1 外源性RIPK3表達 轉染后的2組細胞均表達GFP，在激光共聚焦顯微鏡下可見綠色熒光(圖1)，質粒DNA整合到細胞基因組內。對2組細胞蛋白進行Western blot檢測，對照組僅表達相對分子質量為56 000的內源性RIPK3，實驗組在表達內源性RIPK3的同時，表達相對分子質量為85 000的外源性RIPK3(外源性RIPK3與GFP形成融合蛋白)(圖2)。

圖1 2組細胞轉染的攜帶有RIPK3、空載質粒中均攜帶有GFP標簽，轉染后在激光共聚焦顯微鏡下可觀察到綠色熒光

A.對照組;B.實驗組

Figure 1 SH-SY5Y in both groups expressed GFP after transfection

圖2 外源性RIPK3-GFP在實驗組細胞內表達(內源性RIPK3相對分子質量為 56 000，外源性RIPK3相對分子質量為85 000)

Figure 2 Exogenous RIPK3 was expressed in test group(endogenously expressed RIPK3 has a molecular weight of 56 000,endogenously expressed RIPK3 has a molecular weight of 85 000)

2.2 MTT法檢測2組細胞不同時間點的增殖活性 2組的細胞增殖活性隨著時間的延長逐漸增高，實驗組的16、24、32、40 h增殖活性均較對照組明顯降低(P<0.05),見表2。

表2 2組MTT實驗數據比較

2.3 轉錄組檢測及分析 在IPA數據庫中對RNAseq結果進行數據分析,結果顯示RIPK3下游存在以mTOR為核心的下游信號通路，信號通路中的各基因及作為信號節點的mTOR轉錄受到明顯的調控， SREBPs、S6K、eIF4B、eEF2K及ULK的表達水平發生了相應的改變(圖3)。ddPCR結果表明實驗組與對照組細胞mTOR轉錄水平比值為0.028±0.005vs0.055±0.014 ，其轉錄水平差異有統計學意義(t=3.011,P<0.05)(圖4)。

圖3 mTOR及其下游信號分子轉錄水平改變情況

Figure 3 Transcription level changes of MTOR and its downstream signaling molecules

圖4 ddPCR檢測提示mTOR轉錄水平變化與RNAseq一致

橫坐標為微滴計數，縱坐標為微滴熒光強度，通過檢測PCR管內陽性熒光微滴數目及所占比值，計算得出樣本中的目的基因片段絕對濃度(copies/μL)

Figure 4 ddPCR detection suggested that the change of transcription level of mTOR was consistent with RNAseq

3 討 論

RIPK3是一種典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在RIPK1的作用下被激活，進而發揮廣泛的下游效應。本研究以神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞系作為神經元細胞模型[3]，在細胞內上調RIPK3表達水平。通過RNAseq技術對轉錄組mRNA進行測序，對細胞內由RIPK3上調所引起基因轉錄變化情況進行全面的了解，在IPA數據庫中對測序結果進行分析，獲得受到RIPK3調控的信號通路。對處于核心位置的基因，采用ddPCR對RNAseq結果進行驗證，保證實驗結果的可靠性。RNAseq結果提示，在RIPK3表達水平發生上調的情況下，mTOR及其所在的信號通路中的信號分子SREBPs、S6K、eIF4B、eEF2K及ULK表達發生了不同情況的改變。

mTOR是一種相對分子質量為289 000的絲氨酸/蘇氨酸蛋白酶，在細胞內以mTORC1和mTORC2兩種分子復合體的形式發揮生物學活性[4]。mTORC1在促進髓鞘形成和脊髓髓磷脂厚度的作用強于mTORC2，在調控脂肪合成和髓鞘蛋白翻譯等過程中起到了重要的作用[5]。mTOR介導的細胞內信號通路被認為是調節干細胞功能的關鍵性調控因子[6]，胚胎干細胞中mTOR活性被控制在較低水平，抑制中樞神經系統中mTOR活性能夠通過降低大腦中干細胞的功能而導致嚴重的后果[7]。對早期胚胎的研究發現，mTOR的活化能夠導致皮層結構異常發育、神經退行性變甚至早期死亡[8]。這預示著mTOR在腦早期發育的過程起到關鍵性作用。也有證據表明，mTOR信號通路參與到阿爾茲海默癥的發生和發展過程中[9]，并與無功能性垂體腺瘤的發病具有一定的聯系[10]

本研究結果表明，mTOR及下游效應分子表達的改變受到RIPK3系統化的嚴格調控。其作用機制涉及轉錄、翻譯以及自噬。SREBPs是mTORC1下游最重要的轉錄因子，其活性受到SREBPs在神經系統中的作用尚未完全明確。但有研究表明其在營養監測、興奮性中毒、髓鞘化和神經退行性疾病中發揮重要作用[11]。mTOR對翻譯過程的調控主要通過S6K和4E-BPs。S6K由能夠磷酸化核糖體蛋白S6(ribosomal protein S6，S6)、真核生物起始因子4B(eukaryotic initiation factor 4B，eIF4B)以及真核生物延伸因子2激酶(eukaryotic elongation factor 2 kinase，eEF2K)，從而促進新生肽鏈合成起始和延長[12]。真核生物起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E ，eIF4E)通過與mRNA5′端帽結構相結合發揮負調節的作用，與4E-BPs結合狀態下的eIF4E為失活狀態， 4E-BPs被mTOR磷酸化釋放出的游離狀態的eIF4E才能夠與mRNA的帽狀結構結合[13]。自噬是指細胞對氨基酸、大分子和受損細胞器進行回收的過程，自噬現象在神經元細胞中較非神經元細胞更為明顯，如Tsc2缺陷型神經細胞在mTORC1活化的情況先能夠表現出溶酶體積累增加，并保持自噬能力[14]，mTOR信號通路在脊髓的形成過程中發揮了重要的作用[15]。mTORC1通過與ULK的相互作用對這一過程進行調節，以雷帕霉素抑制mTORC1能夠引起自噬的發生[16]。

研究人員在很多臨床疾病中發現mTOR信號通路的異常情況，這些疾病包括由mTOR信號通路異常引起的單基因遺傳疾病，如結節性硬化、抑癌基因PTEN錯構瘤腫瘤綜合征、多發性神經纖維瘤病；神經發育障礙，如脆性X綜合征、自閉癥、癲癇病；神經退行性疾病，如衰老、阿爾茲海默綜合征、帕金森綜合征、亨廷頓病、精神病等[17]。

綜上所述，RIPK3可以通過對mTOR信號通路的調節而對神經系統的發育及疾病病理產生重要的影響。由于受到諸多條件的限制，本研究并沒有對RIPK3與mTOR信號通路之間的關系進行更加深入的探討，但是仍然支持了RIPK3在神經系統中發揮重要作用的觀點，并為進一步的研究指明了方向。

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The role of RIPK3 overexpression in regulation of the transcription of mTOR and downstream genes

ZHANG Guo-lu1, CHENG Shi-xiang1, XU Zhong-wei2,YI Tai-long1，TU Yue1*, ZHANG Sai1

(1.Tianjin Key Laboratory of Neurotrauma Repair, Institute of Traumatic Brain Injuryand Neuroscience of Chinese Armed Police Forces (CAPF), Neurology & Neurosurgery Hospital of CAFP, Tianjin 300162, China; 2. Center Laboratory of Logistics University of CAPF, Tianjin 300309, China)

Objective The aim of this study is to investigate the downstream pathway of receptor-interacting protein kinase 3(RIPK3). Methods SH-SY5Y was stably transfected with pCMV6-RIPK3 recombinant plasmid to up-regulate expression of RIPK3, while control group was transfected with empty vector. RIPK3 level in transfected SH-SY5Y cells were determined using western blot. Cell proliferation activity was measured by MTT to detect the activity of exogenous RIPK3. The differentially transcripted genes between two groups were identified by RNAseq. Ingenuity pathway analysis(IPA) revealed a great role of RIPK3 and its downstream signal pathways and the key molecule mammalian target of rapamycin (mTOR). Droplet digital PCR(ddPCR) analysis was used to further confirm expression of mTOR. Results Plasmid DNA was integrated into the cell genome. Western blotting results suggested that exogenous RIPK3 was expressed in experimental group. MTT results showed that exogenous RIPK3 could inhibit cell viability. RNAseq and IPA shown that overexpression of RIPK3 upregulated the transcription levels of mTOR, and affected downstream genes such as sterol-response binding proteins(SREBPs), p70 ribosomal S6 protein kinases(S6K), eukaryotic initiation factor 4E-binding proteins(4E-BPs) and unc-51-like kinase (ULK). ddPCR analysis show that the change of the expression level of mTOR was the same as that of RNAseq. Conclusion RIPK3 could regulate transcription of mTOR signal cascade and play an important role in development, inflammation and tumorigenesis of the nervous system.

neuroblastoma; receptor-interacting protein kinase 3; gene expression regulation

2015-11-23；

2016-03-02

國家自然科學基金青年科學基金項目(31200809)；武警部隊后勤科研項目(WJHQ2012-20)；武警后勤學院科研創新團隊(WHTD201306)

張國祿(1990-)，男，遼寧朝陽人，武警后勤學院附屬醫院醫學碩士研究生，從事神經外科學疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail:ytumail@vip.126.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2016.04.002

R730.264

A

1007-3205(2016)04-0377-05

許卓文)