丁苯酞聯合依達拉奉對局灶性腦梗死大鼠皮質血腦屏障及咬合蛋白表達的影響

王麗娜，王麗娟，胡振芳，劉世炎，劉永亮，王 鵬

(1.河北省唐山市人民醫院神經外科， 河北 唐山 063000；2.河北省唐山市豐潤區第二人民醫院檢驗科，河北 唐山 063000；3.河北省唐山市中醫醫院彩超室， 河北 唐山 063000)

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·論 著·

丁苯酞聯合依達拉奉對局灶性腦梗死大鼠皮質血腦屏障及咬合蛋白表達的影響

王麗娜1，王麗娟2，胡振芳3，劉世炎1，劉永亮1，王 鵬1

(1.河北省唐山市人民醫院神經外科， 河北 唐山 063000；2.河北省唐山市豐潤區第二人民醫院檢驗科，河北 唐山 063000；3.河北省唐山市中醫醫院彩超室， 河北 唐山 063000)

目的探討丁苯酞聯合依達拉奉對局灶性腦梗死大鼠皮質血腦屏障及咬合蛋白表達的影響。方法選取成年SD 雄性大鼠60只, 隨機分為對照組、模型組、丁苯酞組、丁苯酞聯合依達拉奉組，每組15只。各組于模型制作成功后72 h采用伊文思蘭滲出法檢測大鼠血腦屏障通透性變化，免疫組織化學和Western blot檢測損傷區周圍皮質咬合蛋白表達變化。結果與對照組比較，模型組、丁苯酞組、丁苯酞聯合依達拉奉組梗死區大腦皮層血腦屏障通透性均增加，皮質咬合蛋白表達均減少。與模型組相比，丁苯酞組和丁苯酞聯合依達拉奉組皮質腦組織伊文思藍滲出量減少，皮質咬合蛋白表達增加。與丁苯酞組比較，丁苯酞聯合依達拉奉組伊文思藍滲出量減少，咬合蛋白表達量增加。結論丁苯酞軟膠囊可保護血腦屏障，增加大腦皮質咬合蛋白的表達。與依達拉奉聯合應用保護血腦屏障、增加咬合蛋白表達作用更明顯。

腦梗死；血腦屏障；丁苯酞軟膠囊；依達拉奉

急性腦梗死是目前臨床常見的缺血性腦血管病，嚴重危害著人類的健康。腦水腫是急性腦梗死的主要病理過程之一，可加重腦梗死患者的腦組織損傷，影響患者的預后。丁苯酞對輕、中度急性缺血性腦卒中有明顯的治療作用[1]。依達拉奉具有清除自由基的作用，是臨床常用的治療急性腦梗死的藥物[2]。丁苯酞聯合依達拉奉在治療急性腦梗死后腦水腫形成的研究尚未見報道。本研究采用伊文思藍滲出等方法評價丁苯酞聯合依達拉奉對急性局灶性腦梗死大鼠血腦屏障通透性的影響，并利用免疫組織化學和免疫印記(Western blot)來觀察急性腦梗死后大鼠梗死灶周圍皮質咬合蛋白表達的變化，探索丁苯酞聯合依達拉奉治療腦損傷后腦水腫的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物來源 清潔級3個月齡SD雄性大鼠60只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，體質量280～320 g，許可證號：SCXK(京)2002-003。采用隨機數字表法將60只大鼠分：對照組、模型組、丁苯酞組、丁苯酞聯合依達拉奉組，每組15只。所有實驗過程嚴格遵循科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2 局灶性腦梗死模型制備[1]所有大鼠給予10%水合氯醛3～5 mL/100 g腹腔注射麻醉。模型組、丁苯酞組、丁苯酞聯合依達拉奉組給予玫瑰紅B 15 mg/100 g體質量尾靜脈注射，固定大鼠頭部于立體定向儀上，常規消毒大鼠頭部，沿正中線縱行切開頭皮，暴露顱骨，于前囟右側3 mm后2 mm處，牙科磨鉆磨除顱骨外層形成一直徑約6 mm顱骨缺損，冷光源[(LG-150，徐州恒發有限公司，波長(560±30) nm，光照強度5.6×105勒克斯，照射中心最高溫度為27 ℃)]照射缺損處30 min，關閉切口。待大鼠麻醉清醒后，給予Longa法行為學評分[3]，1～3分者視為模型制作成功。對照組給予0.3 mL生理鹽水尾靜脈注射，暴露顱骨并磨除外板后給予冷光源照射，時間同上。模型組和對照組每日給予0.4 mL植物油灌胃、0.3 mL生理鹽水腹腔注射。丁苯酞組每日給予丁苯酞軟膠囊40 mg/kg植物油稀釋成0.4 mL后灌胃、0.3 mL生理鹽水腹腔注射2次/d。丁苯酞聯合依達拉奉組每日給予丁苯酞軟膠囊40 mg/kg灌胃、依達拉奉3 mg/kg生理鹽水稀釋成0.3 mL腹腔注射2次/d。

Longa行為學評分標準：0分，無神經功能缺損；1分，不能伸展對側前肢；2分，對側前肢屈曲；3分，輕度向對側轉圈；4分，嚴重向對側轉圈；5分，向對側跌倒。

1.3 血腦屏障通透性測定 各組大鼠于術后71 h尾靜脈注射20 g/L伊文思藍3 mL/kg。術后72 h給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉， 37 ℃生理鹽水經左心室穿刺至主動脈進行灌注，直至右心耳流出清亮液體為止。斷頭取腦，取梗死灶周圍皮質約200 mg，電子天平稱質量后，3 mL二甲基甲酰胺浸泡，37 ℃溫水浴48 h，1 500 r/min,離心10 min，取上清液，酶標儀檢測630 nm波長吸光度(A)值，從標準曲線上查得伊文思藍含量。

1.4 免疫組織化學 各大鼠等部位切片3張，脫蠟，脫水，雙氧水消除內源性過氧化物酶，高壓熱修復，1∶100比例稀釋的咬合蛋白一抗浸泡，4 ℃冰箱內過夜，次晨取出置常溫，滴加二抗，37 ℃孵育1 h，二氨基聯苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色，蘇木精復染，脫水，透明，封片。光鏡下觀察細胞核呈藍色，陽性細胞腫脹，包漿黃染。顯微鏡下(×400)隨機選取梗死灶周圍皮層5個視野，Image-Pro-Plus圖像分析系統(美國Media Cybernetics公司)照相后計算每個視野中陽性細胞數目。

1.5 Western blot 細胞裂解液提取各組大鼠梗死灶周圍腦組織總蛋白，應用考馬·斯亮藍比色法測定各個樣本蛋白含量，上樣量為100 μg蛋白。進行電泳，轉膜；山羊抗咬合蛋白多克隆一抗(1∶500稀釋) ，山羊抗actin多克隆一抗(1∶1 000稀釋)，4 ℃過夜，次日加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(1∶1 000稀釋)雜交。EcL發光劑3 min，曝光，顯影，定影。數碼成像分析系統軟件分析各條帶平均灰度值，以目標的平均灰度值比內參的平均灰度值百分比的大小作為分析對象進行比較。

2 結 果

模型組腦組織伊文思藍滲出量較對照組明顯增加，丁苯酞組較模型組明顯減少，丁苯酞聯合依達拉奉組滲透最少(均P<0.05)；咬合蛋白量的表達(包括免疫組織化學法和Westernblot法),模型組較對照組明顯較少，丁苯酞組較模型組明顯增多，丁苯酞聯合依達拉奉組增加最多(均P<0.05)。見表1，圖1、2。

表1 各組動物血腦屏障通透性比較

Table 1 Comparison of blood-brain barrier permeabilities in each groups

組別 血腦屏障通透性(μg/g)咬合蛋白表達量免疫組織化學(個/HP)Westernblot(%)對照組18.00±10.93183.20±6.18144.56±8.43模型組321.20±14.26*55.20±5.26*54.10±6.39*丁苯酞組280.60±13.81*#93.20±5.89*#87.04±5.51*#丁苯酞聯合依達拉奉組203.60±19.87*#△135.60±5.13*#△120.06±4.50*#△ F397.709478.798190.930 P0.0000.0000.000

*P<0.05與對照組比較 #P<0.05與模型組比較 △P<0.05與與丁苯酞組比較(SNK-q檢驗)

圖1 梗死周圍皮質咬合蛋白陽性細胞數(免疫組織化學染色 ×400)

A.對照組;B.模型組;C.丁苯酞組;D.丁苯酞聯合依達拉奉組

Figure 1 Cell numbers in occludin positive cells in cortex of focal cerebral infarction (immunohistochemistry ×400)

圖2 梗死周圍腦組織咬合蛋白表達

Figure 2 Protein expresssions of occludin in cortex of focal cerebral infarction

3 討 論

國內外大量文獻研究表明，腦水腫是急性腦梗死后重要的病理過程之一，是影響急性腦梗死患者病情嚴重程度及預后的重要因素。而血腦屏障通透性的增高是引起急性腦梗死后腦水腫的重要原因。

血腦屏障是血液與腦組織及腦脊液之間的通透性較低的膜性結構，主要有腦毛細血管內皮細胞、基膜和神經膠質細胞的足突組成，對維持中樞神經系統內環境的穩定和防止有害物質進入有非常重要的作用。當缺血、缺氧、炎癥反應等因素作用于血腦屏障時，可造成血腦屏障基本結構的破壞，從而導致血腦屏障通透性增高，血漿蛋白等大分子物質通過血腦屏障進入腦組織，腦組織膠體滲透壓增高，腦水腫形成[4]。

丁苯酞是我國自行研制的一類治療急性缺血性腦血管病的新藥，具有減輕血腦屏障通透性增高[5]、抑制腦損傷后炎癥反應發生[6]、減輕缺血引起神經功能損傷[7]等作用。張學蘭等[8]研究表明，丁苯酞注射液對進展性腦梗死有明顯的治療作用。

依達拉奉是臨床常用的治療急性腦梗死的藥物，具有60%的血腦屏障通透率。依達拉奉是一種自由基捕獲劑，具有降低自由基濃度的作用，可明顯抑制自由基引起的脂質過氧化，減少遲發性神經元死亡[2]。

咬合蛋白是形成緊密連接的主要跨膜蛋白，而腦微血管緊密連接是形成血腦屏障的基礎，與腦水腫的關系密切。在生理情況下，血腦屏障的緊密連接能對流經腦血管內的絕大多數物質進行嚴格選擇，限制其進入腦組織，維持腦內環境的穩定。緊密連接的結構完整性是保障血腦屏障功能正常發揮的前提。跨內皮細胞電阻可反映內皮細胞的屏障通透性，咬合蛋白含量越高，跨內皮細胞電阻也越高，而血腦屏障通透性則越小，反之亦然。咬合蛋白表達減少，緊密連接的破壞將導致血腦屏障通透性增高，腦水腫形成[9]。研究表明丁苯酞具有抑制彌漫性腦損傷大鼠皮層咬合蛋白表達的作用[10]。本研究結果表明急性腦梗死后腦組織可能通過減少梗死灶周圍皮層咬合蛋白的表達，導致血腦屏障通透性增加，腦水腫加重，而丁苯酞軟膠囊可減少咬合蛋白的破壞，從而減輕血腦屏障通透性的增加，減輕腦水腫；丁苯酞與依達拉奉聯合應用咬合蛋白破壞量更少，保護血腦屏障通透性作用更明顯。

綜上所述，丁苯酞對急性腦梗死具有明顯的治療作用，丁苯酞與依達拉奉聯合應用保護血腦屏障的作用更明顯，可能與兩藥聯合應用減輕炎癥反應、抑制自由基密切相關。

[1] 王鵬,王麗娜,劉永亮,等.丁苯酞對局灶性腦缺血大鼠腦水腫和梗死周圍組織磷酸化肌球蛋白輕鏈表達的影響[J].國際腦血管病雜志,2014,22(5)：376-380.

[2] 林昌福,于朝春,齊一龍.依達拉奉對腦出血大鼠腦組織含水量、腫瘤壞死因子-α含量、血清基質金屬蛋白酶-9水平和超氧化物歧化酶活性的影響[J].臨床神經病學雜志,2012,25(5):362-364.

[3] 張春梅,王麗娜,劉永亮.丁苯酞對局灶性腦梗死大鼠皮層Rho相關激酶Ⅱ蛋白表達的影響[J].河北醫科大學學報,2014,35(9):1003-1005.

[4] 侯景明,黎海濤.血腦屏障破壞與腦水腫發生研究進展[J].國際神經病學神經外科學雜志,2010,37(3):260-263.

[5] 紀海茹，孔令偉，孔維，等.丁苯酞對腦缺血再灌注損傷大鼠血腦屏障的影響[J].中華老年心腦血管病雜志,2015,17(3):307-309.

[6] 牛慧艷，張占強，魏美玲，等.丁苯酞對腦梗死后相關炎性因子的影響研究進展[J].中國實用神經疾病雜志,2015,18(9):124-125.

[7] 王建,董力,賈晨紅.丁苯酞注射液對急性腦梗死患者神經功能及腦血管儲備功能的影響[J].實用臨床醫藥雜志,2015,19(11)：117-118.

[8] 張學蘭,段薇靜,趙延寧,等.丁苯酞注射液治療進展性腦梗死的療效觀察[J].河北醫科大學學報,2015,36(5):565-567.

[9] 常玉坤,王麗娜,劉永亮,等.彌漫性腦損傷大鼠血腦屏障及損傷區皮質咬合蛋白表達的變化[J].疑難病雜志,2013,12(9):702-705，后插1頁.

[10] 孫東良,王麗娜,劉永亮,等.丁苯酞對彌漫性腦損傷大鼠腦水腫及皮層基質金屬蛋白酶9、咬合蛋白表達的影響[J].河北醫科大學學報,2014,35(7):756-760.

Effects of butylphthalide combined with edaravone on blood-brain barrier permeability and occludin expressions in cortex of focal cerebral infarction in rats

WANG Li-na1, WANG Li-juan2, HU Zhen-fang3,LIU Shi-yan1, LIU Yong-liang1, WANG Peng1

(1.Department of Neurosurgery, the People's Hospital of Tangshan City, Hebei Province, Tangshan 063000, China; 2. Department of Laboratory, the Second People's Hospita of Fengrun District,Hebei Province, Tangshan 063000, China; 3. Department of Color Ultrasonic Room,the Hospital of Traditional Chinese Medicine of Tangshan City, Hebei Province,Tangshan 063000, China)

Objective To explore the effects of butylphthalide combined with edaravone on blood-brain barrier permeability and occludin expressions in cortex of focal cerebral infarction in rats. Methods Sixty sprague-dawley male rats were randomly divided into four groups: control group, model group, butylphthalide group and butylphthalide combined with edaravone group, with 15 rats in each group. The model was established based on the principle of photochemical initiation of thrombosis. At 72 h after injury, evans blue extravsation method was used to detect the blood-brain barrier permeability. Immunohistochemistry and western blot were used to examine the cortex occludin expression around the infarction area. Results Compared with the control group, the blood-brain barrier permeabilities in the model group, butylphthalide group and the butylphthalide combined with edaravone group were increased significantly. And the occludin expressions aroud the infarction were upregulated significantly. Compared with the model group: evans blue extravsations in cortex in the butylphthalide group and in the butylphthalide combined with edaravone group were decreased, and the occludin expressions aroud the infarction area were increased. Compared with the the butylphthalide group: evans blue extravsation in cortex in the butylphthalide combined with edaravone group was decreased, and the occludin expression aroud the infarction was increased. Conclusion Butylphthalide could protect the bolld-brain barrier, and increase the expression of occludin. The effect was more obvious by using the combination of butylphthalide and edaravone.

brain infarction; blood-brain barrier; butylphthalide; edaravone

2015-09-14；

2015-11-03

王麗娜(1976-)，女， 河北唐山人，河北省唐山市人民醫院主管護師，醫學學士，從事臨床護理學研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2016.04.004

R743.33

A

1007-3205(2016)04-0385-04

許卓文)