缺氧誘導因子1α在促卵泡激素促進卵巢癌SKOV3細胞增殖與侵襲中的作用

黃 平，張立民*，黃冬冬，裴新偉，史春燕

(1.河北省滄州市中心醫院婦一科，河北 滄州 061000；2.滄州醫學高等?？茖W校診斷教研室，河北 滄州 061000)

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·論 著·

缺氧誘導因子1α在促卵泡激素促進卵巢癌SKOV3細胞增殖與侵襲中的作用

黃 平1，張立民1*，黃冬冬2，裴新偉1，史春燕1

(1.河北省滄州市中心醫院婦一科，河北 滄州 061000；2.滄州醫學高等專科學校診斷教研室，河北 滄州 061000)

目的探討缺氧誘導因子1α(hypoxia-induced factor-1α，HIF-1α)抑制促凋亡因子Bid、Bim、Puma在卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)促進卵巢癌SKOV3細胞增殖與侵襲中的作用。方法培養卵巢癌SKOV3細胞株，并分為對照組、FSH組、HIF-1α抑制組，其中FSH組以40 U/L FSH處理SKOV3細胞48 h，HIF-1α抑制組先以HIF-1α抑制劑甲氧基雌二醇(2-Methoxyestradiol，2ME，5 μmol/L)作用72 h，再加入FSH(40 U/L)處理48 h，采用四甲基偶氮唑藍法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)檢測細胞的增殖能力，體外侵襲實驗檢測細胞侵襲能力，免疫蛋白印記法檢測HIF-1α及促凋亡因子Bid、Bim、Puma的表達。結果與FSH組相比，HIF-1α抑制組細胞增殖率、侵襲能力、HIF-1α表達均明顯下降(P<0.05)，促凋亡因子Bid、Bim、Puma表達明顯上升(P<0.05)。結論FSH可能通過激活HIF-1α降低促凋亡因子Bid、Bim、Puma表達，促進卵巢癌細胞的增殖與侵襲。

卵巢腫瘤；卵泡刺激素；缺氧誘導因子1α

卵巢癌已成導致發達國家婦女死亡的第5位婦科惡性腫瘤[1]。已有研究表明，過量的卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)通過增加缺氧誘導因子1α(hypoxia-induced factor-1α，HIF-1α)表達，促使腫瘤血管增生、轉移，但其具體發生機制至今尚未闡明[2]。Bid、Bim和Puma是Bcl-2家族重要的促凋亡因子，在引發Bax和Bak形成線粒體膜寡聚蛋白通道、釋放細胞色素C、促進腫瘤發生和細胞凋亡中起著重要的作用[3]。本研究通過檢測FSH對加入HIF-1α抑制劑甲氧基雌二醇(2-Methoxyestradiol，2ME)的卵巢癌SKOV3細胞中Bid、Bim、Puma表達的影響，探討其腫瘤發生發展機制，旨在為臨床研究提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 材料來源 卵巢癌細胞株SKOV3由中國醫科大學附屬盛京醫院中心實驗室惠贈，滄州市中心醫院中心實驗室傳代保存。注射用重組人FSH購自瑞士Laboratoires Serono SA公司，HIF-1α抑制劑2ME購自美國San Diego公司，兔抗人Bid、Bim、Puma抗體購自美國Abcam公司，山羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司，胎牛血清、RPMI 1640、胰蛋白酶及青霉素購自美國Gibco公司。

1.2 SKOV3細胞培養 卵巢癌細胞株SKOV3接種于含有10%胎牛血清和100 kU/L青霉素的RPMI 1640培養基中，將培養皿放入37 ℃、5%CO2的培養箱(Thermo，美國)中培養，細胞呈貼壁生長，當細胞生長至70%～80%時，胰蛋白酶消化、傳代，取對數生長期的SKOV3細胞用于實驗。

1.3 四甲基偶氮唑藍法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)檢測SKOV3細胞的增殖能力 將實驗細胞分為3組，即對照組、FSH組、HIF-1α抑制組，其中HIF-1α抑制組中已使用HIF-1α抑制劑2ME(5 μmol/L)作用72 h。常規胰酶消化計數后，取96孔培養板，每孔接種200 μL(含有5×104個細胞)，均設置5個復孔，培養6～8 h，待細胞貼壁后，參考既往文獻[4-5]，FSH組更換為含有FSH 40 U/L的培養基，HIF-1α抑制組更換為含有FSH 40 U/L及2ME 5 μmol/L的培養基。將96孔培養板放入37 ℃、5%CO2的培養箱中培養48 h，以不含有細胞、只加培養基的空白孔作為校準孔。在對照組、FSH組、HIF-1α抑制組細胞中，每孔中加入MTT溶液(5 g/L)20 μL，同樣條件下繼續孵育4 h后終止培養。棄上清液后每孔加入150 μL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)并振蕩10 min，置酶標儀于490 nm波長處測定各孔吸光度(A值)，計算細胞生長增殖率，細胞生長增殖率(%)=(AFSH-A空白對照)/(A對照-A空白對照)×100%。實驗重復3次并取均值[3]。

1.4 體外侵襲實驗檢測SKOV3細胞的侵襲能力 在置有聚碳酸酯膜(8 μm孔徑)的Transwell小室底部膜的上室面使用100 mL Matrigel鋪成人工底模，37 ℃下放置2 h，并置于超凈臺內紫外線照射風干過夜。使用前30 min重新水化成膠。在預包被的Transwell小室中每孔加入SKOV3細胞懸液200 μL(含有2×104個細胞)，其中HIF-1α抑制組中已使用HIF-1α抑制劑2ME(5 μmol/L)作用72 h，下室加入RPMI 1640培養基500 μL，37 ℃、5%CO2的培養箱中培養，待細胞貼壁后，各組更換相應培養基(同MTT法)并處理48 h。使用無菌棉簽擦去Transwell小室上未穿過的細胞，風干后用0.1%結晶紫染色30 min，倒置顯微鏡下(×100)計數10個不同視野中的穿膜細胞數。實驗重復3次并取均值[6]。

1.5 蛋白免疫印跡分析 同MTT法分組及處理， FSH組以40 U/L的FSH處理SKOV3細胞48 h，HIF-1α抑制組中先以HIF-1α抑制劑2ME(5 μmol/L)作用72 h，再加入FSH(40 U/L)處理48 h。收集各組細胞并使用裂解液(碧云天生物制劑有限公司，中國)將細胞裂解，煮沸使蛋白變性，使用BCA蛋白定量試劑盒(碧云天生物制劑有限公司，中國)檢測蛋白質濃度。50 μg蛋白質上樣后6聚丙烯酰氨凝膠電泳中電流恒定進行電泳，電壓恒定濕轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，TBST洗膜，分別加入兔抗人Bid、 Bim、Puma或HIF-1α(1∶500)，37 ℃ 下1 h孵育后，TBST洗膜3次，每次10 min。山羊抗兔二抗(1∶1 000)25 ℃ 1 h孵育，TBST洗膜3次，每次10 min，ECL發光，以GADPH作為內參照[3]。

2 結 果

2.1SKOV3細胞生長增殖率與細胞侵襲能力比較MTT比色法檢測顯示，SKOV3細胞在經過濃度為40U/L的FSH處理48h后，其細胞增殖率明顯高于對照組(P<0.05)。 經過HIF-1α抑制劑2ME(5μmol/L)預先處理72h后，HIF-1α抑制組細胞增殖率與FSH組相比明顯降低(P<0.05)，但仍高于對照組(P<0.05)。FSH組的穿過細胞數明顯多于對照組(P<0.05)，而HIF-1α抑制組的穿過細胞數明顯少于FSH組(P<0.05)，但仍高于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 3組SKOV3細胞生長增殖率和細胞侵襲能力比較

組別 細胞增殖率(%)穿過細胞數(個)對照組100.00±1.1324.0±8.0FSH組173.21±0.93*125.0±16.0*HIF-1α抑制組126.73±1.18*#45.0±10.0*# F5824.930101.441 P0.0000.000

*P<0.05與對照組比較 #P<0.05與FSH組比較(SNK-q檢驗)

2.2 SKOV3細胞中HIF-1α、Bid、Bim及Puma蛋白的表達 與對照組比較，FSH組中HIF-1α蛋白表達量明顯升高(P<0.05)；與FSH組比較，HIF-1α抑制組中HIF-1α表達量明顯下降(P<0.05)；與對照組比較，FSH組Bid、Bim和Puma蛋白的表達明顯降低(P<0.05)，與FSH組比較，HIF-1α抑制組的Bid、Bim和Puma蛋白的表達明顯回升，但仍低于對照組(P<0.05)。見圖1，表2。

圖1 SKOV3細胞中HIF-1α、Bid、Bim及Puma蛋白表達

C.對照組；F.FSH組，H.HIF-1α抑制組

表2 3組SKOV3細胞中HIF-1α、Bid、 Bim及Puma蛋白表達比較

組別 HIF-1αBidBimPuma對照組0.21±0.050.52±0.070.73±0.020.47±0.08FSH組0.93±0.05*0.25±0.04*0.27±0.03*0.11±0.06*HIF-1α抑制組0.38±0.04*#0.44±0.05*#0.52±0.03#0.32±0.05*# F321.89432.0568.71339.240 P0.0000.0000.0050.000

*P<0.05與對照組比較 #P<0.05與FSH組比較(SNK-q檢驗)

3 討 論

本研究觀察了卵巢癌SKOV3細胞在給予FSH處理和HIF-1α抑制劑后對細胞增殖率和侵襲能力的影響，并觀察了2種處理對促凋亡因子Bid、Bim、Puma的影響。結果發現，FSH能夠顯著提高SKOV3細胞增殖率及侵襲能力，并降低促凋亡因子Bid、Bim、Puma的表達，但經過HIF-1α抑制劑2ME處理后，FSH提高SKOV3細胞增殖率及侵襲能力的作用顯著下降，促凋亡因子Bid、Bim、Puma的表達顯著升高。表明FSH促進卵巢癌SKOV3細胞增殖及侵襲的作用可能與增加HIF-1α表達后抑制Bid、Bim、Puma表達有關。

FSH作為腺垂體分泌的一種糖蛋白激素，在促進卵巢癌的增殖及侵襲中發揮著重要的作用[7]。根據既往國內外的研究以及我們的預實驗，采用40 U/L FSH處理SKOV3細胞48 h，發現細胞的增殖率及侵襲能力最高，同時，這一濃度在絕經后婦女外周血FSH水平范圍內，支持促性腺激素致癌的觀點[7-8]。

FSH通過激活HIF-1α在促進卵巢癌細胞增殖與侵襲過程中發揮著重要作用[9]。本研究在給予HIF-1α抑制劑2ME處理SKOV3細胞后，HIF-1α表達下降，FSH提高SKOV3細胞增殖率及侵襲能力的作用也顯著下降，與之前的研究結果一致[10]。表明HIF-1α在接受到FSH信號傳導后可能通過抑制凋亡或促進增殖基因的表達誘發卵巢癌細胞的增殖與侵襲。

通過進一步的研究發現，促凋亡因子Bid、Bim和Puma在接受HIF-1α抑制劑2ME處理后表達增加，說明HIF-1α的表達下降可能導致促凋亡因子Bid、Bim和Puma的表達上升，促進細胞凋亡。Bid、Bim、Puma可以通過激動Bak、Bax或者使Bcl-2、Bcl-XL、MCL-1失活，促進Bak和Bax形成寡二聚體，介導細胞色素C從線粒體釋放入細胞質。最近引人注目的一項發現表明，通過Bid、Bim和Puma基因共敲除鼠的研究發現，Bid、Bim和Puma能夠直接激活Bax和Bak，從而啟動凋亡程序。既往的各種研究表明Bid、Bim和Puma作為促凋亡的關鍵分子，引發Bax和Bak形成線粒體膜寡聚蛋白通道，釋放細胞色素C，促進細胞凋亡[3,11]。

在體外實驗中，結腸癌細胞已被證實在缺氧條件下Bid mRNA和蛋白表達均受到抑制，這可能是由于HIF-1α通過與Bid的啟動子相結合抑制Bid表達所導致的[12]。另外一項研究也發現，結腸癌患者腫瘤組織中HIF-1α表達增高細胞和組織中伴有Bid表達的下降，而HIF-1α表達降低細胞和組織中伴有Bid表達的上升[4]。在眾多腫瘤細胞的失巢性凋亡抵抗機制中，HIF-1α減少Bim表達也成為近來所關注的熱點[13-14]。在卵巢癌抗藥試驗中Puma基因表達的增加也伴有HIF-1α的表達下降[15]。以上研究及本研究結果均表明，抑制HIF-1α可能通過促進Bid、Bim、Puma表達引發細胞凋亡。

綜上所述，本研究發現FSH能夠顯著提高SKOV3細胞增殖率及侵襲能力，并降低促凋亡因子Bid、Bim、Puma的表達，但經過HIF-1α抑制劑2ME處理后，FSH提高SKOV3細胞增殖率及侵襲能力的作用顯著下降，而促凋亡因子Bid、Bim、Puma的表達顯著提高。說明FSH可能通過激活HIF-1α降低促凋亡因子Bid、Bim、Puma表達，從而促進卵巢癌細胞的增殖與侵襲，這可能為卵巢癌的治療提供新的思路。

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2015-05-13；

2015-06-25

黃平(1978-)，女，河北滄州人，河北省滄州市中心醫院主治醫師，醫學碩士，從事婦科疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail:azai2005@sina.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2016.04.020

R737.31

B

1007-3205(2016)04-0450-04

許卓文)