外固定架加壓-牽開-再加壓治療非感染性骨折不愈合實驗研究

段建偉　魏俊強　張猛　閆石

067000 承德，承德醫學院附屬醫院創傷小兒骨科，在讀研究生(段建偉，張猛)

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外固定架加壓-牽開-再加壓治療非感染性骨折不愈合實驗研究

段建偉魏俊強張猛閆石

067000 承德，承德醫學院附屬醫院創傷小兒骨科，在讀研究生(段建偉，張猛)

【摘要】目的探討外固定架加壓-牽開-再加壓技術治療非感染性骨折不愈合的療效及可能的生物學機制。方法建立新西蘭大白兔股骨干非感染性骨折不愈合模型，將造模成功的87只兔按不同處理方法隨機分為實驗組、對照組、空白對照組各29只。將實驗組骨折不愈合端復位后用外固定架進行加壓-牽開-再加壓治療；將對照組的骨折不愈合斷端復位后用外固定架加壓，但不牽開；將空白對照組的骨折不愈合斷端復位后用外固定架固定，保證骨折端接觸，既不加壓也不牽開。于處理后的第2、4、6、8、12周對3組進行X線片骨痂評定，對截取的骨樣本進行組織學觀察，采用免疫組織化學檢查觀察骨痂中VEGF的表達情況(著色細胞個數)。結果實驗組的骨折愈合率高于其他2組(P均<0.017)。 處理后第8、12周時，實驗組可見大量新骨形成，成骨細胞貼附于骨的邊緣，且成骨過程基本完成；對照組未見軟骨細胞及成骨細胞的增生，骨痂量也未見明顯的增多；空白對照組斷端為成熟的纖維結締組織，有少量的軟骨痂及骨痂。有關VEGF的表達情況，處理后2～4周時實驗組和對照組著色細胞個數比較差異均無統計學意義(P均>0.05)，但均較空白對照組多(P均<0.05)；6～12周時實驗組著色細胞個數均較對照組多(P均<0.05)。結論外固定架加壓-牽開-再加壓技術治療非感染性骨折不愈合有效，該法可能通過增加VEGF的表達達到治療效果。

【關鍵詞】新西蘭大白兔；伊利扎羅夫技術；外固定架；加壓-牽開-再加壓；張力-應力法則；骨折，不愈合

Compression-distraction-compression; Tension-stress principle; Fracture，Nonunion

近年來，隨著我國工業和建筑業的發展，高能量損傷大量增加，骨折患者也增加，骨折經治療后不愈合的發生率為5%～10%[1-2]。經典的治療骨折不愈合的方法為重建骨折愈合所需的力學因素，顯露骨折不愈合處，去除硬化的纖維組織后暢通髓腔，取髂骨植骨。此法雖然能使一些骨折不愈合或延遲愈合的病例實現愈合，但其創傷大，會造成骨折斷端血運的破壞，存在感染風險，造成髂骨部分缺失及后續并發癥。使用外固定架具有操作簡單、手術時間短、出血少、愈合時間早等優勢，有報道示，近幾年出現的新技術即應用了外固定架加壓-牽開-再加壓治療非感染性骨折不愈合[3]。本研究組擬從影像學、組織學、免疫組織化學檢查(免疫組化)等方面對此技術進行研究。

材料與方法

一、實驗動物

102只8月齡、體質量為1.5～2.5 kg的雄性新西蘭大耳白兔作為實驗動物，由北京金牧陽實驗動物有限公司提供。動物分籠標準飼養于清潔級環境下(承德醫學院附屬醫院實驗動物中心)，自由活動，溫度控制于(25.0±0.5)℃，濕度為60%，定期消毒排風，飼養16周。試驗中對兔的處置符合動物倫理學要求[4]。

二、實驗模型的建立

根據趙震宇等[5-6]的方法建立兔股骨骨折不愈合模型。將戊巴比妥鈉50 mg/kg靜脈注射于兔的耳緣靜脈將其麻醉后，用電動褪毛器為其褪毛，常規碘伏消毒、鋪單，手術過程嚴格無菌操作。取左股骨干外側切口，暴露股骨中段。置入外固定架，在股骨遠、近端分別用電鉆自股骨外側垂直股骨干鉆透雙側骨皮質，平行擰入2枚直徑2.0 mm半針，安裝外固定架。用線鋸將股骨截斷，并去除截骨部位的骨膜和骨髓，并使骨折斷端分離1.5 cm，然后徹底止血、沖洗傷口、逐層縫合[7]。術后肌內注射青霉素40萬U，1次/日，共3 d。將兔分籠飼養，于術后8周攝X線片檢查模型是否制作成功，成功則如圖1A。102只兔中有5只因腹瀉和麻醉意外死亡，9只因造模術后切口感染及內固定失效而無法進行下一步實驗，余下87只造模成功。

三、造模成功后的處理方法

將造模成功的87只兔隨機分為實驗組、對照組、空白對照組，每組各29只。將實驗組骨折不愈合斷端復位后用外固定架進行加壓-牽開-再加壓治療，先以0.5 mm/d的速度持續加壓4周，然后以0.5 mm/d的速度持續牽開2周，再以同樣的速度加壓4周；將對照組的骨折不愈合斷端復位后用外固定架加壓，以0.5 mm/d的速度持續加壓4周；將空白對照組的骨折不愈合斷端復位后用外固定架固定，保證骨折端接觸，既不加壓也不牽開。

四、X線片檢查

于處理后的第2、4、6、8、12周將3組麻醉后分別用計算機X線成像記錄X線片拍攝情況，參照Ciotakis等[8]制定的X線片骨痂評定標準判斷治療效果，即：斷端邊緣稍模糊，骨膜反應輕度，無骨痂者為0分；斷端邊緣明顯模糊，內外骨痂密度略高于軟組織，骨折間隙1/2以上出現骨痂者為1分；斷端邊緣大部分消失，內外骨痂密度接近于髓腔，骨折間隙1/2以上出現骨痂連接者為2分；斷端邊緣趨于消失，內外骨痂密度近似于皮質骨，骨折間隙1/2以上出現骨痂連接者為3分；斷端邊緣完全消失，內外骨痂密度等同皮質骨并連續，髓腔再通為4分，3～4分為骨折愈合。

五、制作標本

處理后的第2、4、6、8、12周行X線片檢查后，3組分別隨機選取5只兔處死，截取其左股骨中段骨痂和軟組織，將骨痂和軟組織用生理鹽水沖洗后立即放入4%多聚甲醛(pH=7.4)中，于4℃固定24～48 h，用20%乙二胺四乙酸二鈉(EDTA2Na)脫鈣2～6周，3～4 d更換1次脫鈣液，脫鈣滿意后，用梯度酒精進行脫水，二甲苯透明，縱向石蠟包埋，做成層厚6 μm的縱向組織切片，行蘇木素-伊紅(HE)染色，進行組織學觀察。

六、免疫組化染色

將石蠟包埋后的組織塊切片后按說明書操作進行免疫組化染色，在20×20顯微鏡視野下，以細胞計數方法測定血管內皮生長因子(VEGF)表達程度，隨機選擇5個視野，對細胞(包括著色和未著色)進行計數。試驗中所用VEGF多克隆抗體由上海艾博抗貿易有限公司提供，組織的染色采用SP法。

七、統計學處理

結果

一、影像學觀察結果

1.實驗組

治療第2周時骨折斷端邊緣稍模糊，骨痂密度略高于軟組織，斷端出現將近1/2骨痂(圖1B)；第4周時，斷端邊緣明顯模糊，骨折間隙1/2以上出現骨痂；第6周時，斷端邊緣大部分消失，骨痂密度接近髓腔(圖1C)；第8周時，斷端邊緣趨于消失，骨痂密度近似皮質骨，骨折間隙1/2以上出現骨痂連接；第12周時，剩余的9只兔中除1只(1/9)因內固定失效、骨折未愈合處，其余8只(8/9)兔骨折斷端完全消失，骨痂密度等同皮質骨，骨折愈合(圖1D)。

圖1　實驗組各時間非感染性骨折不愈合恢復情況

A：模型制作成功(箭頭所示)；B：斷端加壓4周后；C：牽開2周后；D：處理后第12周

2.對照組

第2周時，骨折斷端模糊，骨痂密度略高于軟組織，斷端出現近1/2骨痂；第4周時，斷端邊緣明顯模糊，內外骨痂密度接近于髓腔；第12周時，剩余的9只兔中有7只(7/9)斷端骨痂連接少于50%，髓腔未再通，骨折未愈合。2只(2/9)斷端邊緣消失，髓腔再通，骨折愈合。

3.空白對照組

第4周時，萎縮、硬化的骨折斷端未出現輕度骨膜反映，未見骨痂；第12周時，所有兔的骨髓腔仍為封閉，無1只愈合。

術后各組不同時間X線片骨痂評定情況見表1。第12周時，3組總體骨折愈合情況比較差異有統計學意義(P<0.05)；兩兩比較示實驗組的骨折愈合率高于其他2組(P均<0.05/3)。

表1　實驗組、對照組及空白對照組不同時間X線片骨痂評定情況±s)　分

注：3組12周總體比較F=62.672，P<0.001；不同時間總體比較F=11.602，P<0.01

二、組織學觀察

第2周時，實驗組和對照組骨折斷端有大量的炎性細胞浸潤(圖2A)；空白對照組斷端為成熟的纖維結締組織(圖2B)。第4周時，實驗組和對照組靠近骨折斷端的兩側有少量骨膜細胞增生，已有部分成骨，并開始出現少量的軟骨細胞填充骨折區，已無纖維結締組織和肉芽組織，有少量血管生成，可見極少量吞噬死骨塊的破骨細胞。第6周時，實驗組出現大量的軟骨細胞增生，并開始分泌軟骨基質，成骨細胞也明顯增多，其中可見由成骨細胞增生而來的骨小梁(圖2C、D)；對照組軟骨細胞及成骨細胞未見明顯增多，有少量的骨痂形成。第8、12周時，實驗組可見大量新骨形成，成骨細胞貼附于骨的邊緣，且成骨過程基本完成；對照組仍未見軟骨細胞及成骨細胞的增生，骨痂量也未見明顯的增多；空白對照組斷端為成熟的纖維結締組織，有少量的軟骨痂及骨痂。

圖2　非感染性骨折不愈合組織學觀察圖

A：纖維組織向軟骨細胞轉化(箭頭所示)， HE×100；B：骨折不愈合病理，HE×100；C：軟骨細胞(箭頭所示)，HE×200；D：部分軟骨細胞向成骨細胞轉化(箭頭所示)，HE×100

三、免疫組化觀察結果

細胞(包括著色和未著色)個數見表2。實驗組和對照組骨折斷端開始加壓后的4周內，可見少量輕微著色的單核細胞，著色較深的為肥大和成熟的軟骨細胞，VEGF高表達呈強陽性的為和原始骨小梁相連的軟骨細胞，而骨痂內幼稚的軟骨細胞為陰性，在破骨細胞中也可看到VEGF的表達。4～6周時，實驗組中肥大的軟骨細胞及成骨細胞內可見VEGF持續高表達，對照組4周時曾可見VEGF高表達情況，但其后未能持續，空白對照組中未發現VEGF高表達的情況。6周后，實驗組骨小梁在逐漸成熟過程中，成骨細胞逐漸減少，VEGF的表達也逐漸下降，而骨基質VEGF為散在陽性。

表2　實驗組、對照組及空白對照組骨痂中不同時間VEGF表達(著色細胞個數)的變化±s)　個

討論

非感染性骨折不愈合分為肥大型和萎縮型。肥大型骨折不愈合的原因為固定不穩后引起的異常應力抑制了骨折愈合的進程。更換穩定的固定可使多能干細胞向成骨細胞分化，使骨折愈合。而萎縮型骨折不愈合斷端組織無生物愈合的能力，治療過程中需給予足夠的生物學刺激促進組織再生。本實驗以新西蘭大白兔為研究對象，依據趙震宇等[5-6]的方法造成股骨萎縮型骨折不愈合模型，造模成功后應用外固定架對斷端采用加壓-牽開-再加壓技術治療骨折不愈合取得成功。

一、外固定架加壓-牽開-再加壓技術治療無菌性骨折不愈合的作用機制

骨折斷端復位后逐漸加壓過程除增加固定的穩定性外，斷端纖維組織受到擠壓逐漸壞死，壞死后的組織誘發炎癥反應，開始刺激骨愈合的過程，重啟骨折斷端愈合的潛能。處理后在對斷端加壓的過程中，斷端處于微小不間斷移動加壓狀態，有利于成骨。而在對斷端牽開的過程中，組織受到持續牽開的應力，促使其再生和修復，使前開的間隙發生成骨過程。而再加壓過程能使新生成的骨組織被嵌壓在斷端，產生類似“自身植骨”的作用。這種加壓-牽開-再加壓的過程被稱為“手風琴”技術[8]。

二、VEGF高表達促進骨折愈合

在實驗過程中，我們通過組織學觀察發現實驗組和對照組斷端被加壓過程中，斷端成熟的纖維結締組織受壓后逐漸轉變為炎性肉芽組織。在加壓的后期(第4周時)可見骨膜細胞增生并部分成骨，開始出現軟骨細胞。對實驗組骨折斷端牽開2周后，斷端的軟骨細胞及成骨細胞明顯增多，而對照組無此現象。對實驗組再加壓4周后，斷端大量新骨形成，髓腔再通，骨折愈合。空白對照組斷端只有少量的軟骨痂及骨痂。同時，免疫組化結果顯示，實驗組和對照組第4周時VEGF的表達量比較差異無統計學意義，而第6、8、12周時實驗組明顯多于對照組。實驗組、對照組VEGF的表達量均多于空白對照組，說明加壓-牽開-再加壓的過程能增加VEGF的表達，這可能是外固定架加壓-牽開-再加壓技術能治愈非感染性骨折不愈合的生物學機制之一。

我們認為造成VEGF增多的原因為：對骨折斷端加壓后，骨折的修復及肉芽組織的增長使得斷端的血供減少、氧分壓降低，缺氧環境能促進成骨細胞中VEGF的表達[9]。VEGF不僅可使血管生成增多，為成骨細胞提供足夠的營養物質形成新的骨小梁，而且能促進成骨[10]。我們觀察到實驗組中VEGF在肥大的軟骨細胞中強表達，其作用可能為通過自分泌和旁分泌的形式促進成骨細胞的增殖、分化、血管形成。相反，既無加壓也無牽開的空白對照組的軟骨細胞中VEGF的表達明顯少，VEGF的減少抑制了軟骨細胞向成骨細胞的轉化和成骨細胞的增殖，該組無一只能治愈。

三、總結

外固定架加壓-牽開-再加壓技術治療非感染性骨折不愈合有效，該法可能通過增加VEGF的表達治愈非感染性骨折不愈合。本實驗不足之處包括：①以新西蘭大白兔為實驗對象，雖達到預期效果，但因新西蘭大白兔與人存在物種差異，外固定架加壓-牽開-再加壓技術應用于臨床需在醫學倫理及臨床的允許下謹慎進行，取得顯著成果后方可應用于臨床；②僅通過對橫行骨折不愈合進行實驗，初步研究促進骨折愈合的軸向應力，尚不能為臨床提供各種骨折類型的參考依據，還需從深度、廣度進一步研究；③此技術不能解決截骨對肢體造成的短縮[10]。

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Experimental study of accordion maneuver in the treatment of non-infected nonunion using external fixator

DuanJianwei,WeiJunqiang,ZhangMeng,YanShi.

DepartmentofPediatricTraumaOrthopedics,theAffiliatedHospitalofChengdeMedicalCollege,Chengde067000,ChinaCorrespondingauthor,YanShi,E-mail:yanshi1967@163.com

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the efficacy and explore the biological mechanism of the accordion maneuver in the treatment of non-infected fracture nonunion. MethodsEighty seven New Zealand white rabbit models with non-infected femoral nonunion were successfully established and randomly divided into three groups (n=29). In the experimental group, the animals were treated with the accordion technique of alternating compression with distraction using external fixator after femoral reduction. In the control group, the rabbits were handled with compression without distraction following femoral reduction. In blank control group, the femoral fracture was fixed after femoral reduction without compression or distraction. At 2, 4, 6, 8, 12 weeks after corresponding treatment, X-ray imaging was performed to assess the callus formation. Immunohistochemistry staining was utilized to measure the expression level of VEGF (quantity of stained cells). ResultsThe percentage of bone union in the experimental group was significantly higher compared with those in the control and blank control groups (P<0.017). At 8 and 12 weeks after treatment, a large quantity of new bone formation was observed and osteoblasts attached to the bone margin. The process of osteogenesis was almost completed. In the control group, neither chondrocyte nor osteoblast proliferation was documented. No apparent increase in callus formation was found. In the blank control group, mature fibrous connective tissue was observed at the end of bone fracture. A slight amount of chondrocyte and bone callus formation was noted. At 2 and 4 weeks, the quantity of stained cells did not significantly differ between the experimental and control groups (P>0.05), whereas both considerably higher than that in the blank control group (both P<0.05). At 6 and 12 weeks, the number of stained cells in the experimental group was significantly higher compared with that in the control group (P<0.05). ConclusionThe accordion technique is an efficacious treatment of non-infected nonunion by up-regulating the expression of VEGF.

【Key words】New Zealand rabbit; Ilizarov technique; External fixator;

DOI:10.3969/j.issn.0253-9802.2016.05.009

基金項目：河北省醫學科學研究課題(ZL20140067)

(收稿日期：2015-11-20)(本文編輯：洪悅民)

·基礎研究論著·

通訊作者，閆石，E-mail：yanshi1967@163.com