SYBR GREEN熒光定量聚合酶鏈反應檢測粘蛋白1在乳腺癌診斷中的應用

孫昌瑞，鄧 君，馮 林，洪 華，江詠梅

(1.四川省醫學科學院·四川省人民醫院檢驗科，四川 成都 610072；2.四川省婦幼保健醫院檢驗科，四川 成都 610071；3.四川大學華西第二醫院檢驗科，四川 成都 610041)

SYBR GREEN熒光定量聚合酶鏈反應檢測粘蛋白1在乳腺癌診斷中的應用

孫昌瑞1，鄧 君1，馮 林2，洪 華1，江詠梅3

(1.四川省醫學科學院·四川省人民醫院檢驗科，四川 成都 610072；2.四川省婦幼保健醫院檢驗科，四川 成都 610071；3.四川大學華西第二醫院檢驗科，四川 成都 610041)

目的 探討SYBR GREEN熒光定量聚合酶鏈反應法檢測外周血循環腫瘤細胞中粘蛋白1基因表達水平在乳腺癌診斷和治療監測中的應用。方法 以β-actin為內對照，采用SYBR GREEN熒光定量聚合酶鏈反應法測定45名健康女性體檢者、91例良性乳腺疾病患者和193例乳腺癌患者以及87例其它腫瘤患者外周血中粘蛋白1的表達量，分析不同臨床病理因素與基因表達的相關性。結果 乳腺癌患者粘蛋白1陽性率顯著高于健康體檢者、良性乳腺疾病和其它腫瘤患者(P< 0.05)；良性乳腺疾病及其它腫瘤患者粘蛋白1陽性率顯著高于健康體檢者(P< 0.05)，而良性乳腺疾病與其它腫瘤患者粘蛋白1陽性率差異無統計學意義(P> 0.05)； 乳腺癌臨床分期、組織學分級、腋淋巴結轉移及HER2/neu表達是MUC1 mRNA表達獨立相關因素(P< 0.05)。結論 SYBR GREEN 熒光定量聚合酶鏈反應法是靈敏較高、特異較強的快速定量檢測粘蛋白1方法，可有效監測乳腺癌診斷、療效、轉移和預后。

SYBR GREEN；熒光定量聚合酶鏈反應；粘蛋白1；乳腺癌

2011年1月至2014年6月四川省人民醫院采用SYBR GREEN 實時熒光定量PCR檢測45例健康女性體檢者、91例良性乳腺疾病患者、193例乳腺癌患者和87例其它腫瘤患者外周血中粘蛋白1(human mammaglobin，MUC1)基因的表達量，探討其對乳腺癌診斷和療效監測的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2011年1月至2014年6月來自四川省人民醫院門診和住院部的91例良性乳腺疾病患者(年齡28～77歲)、193例乳腺癌患者(年齡31～78歲)以及87例其它腫瘤患者(年齡32～81歲)，均經病理學確診。91例良性乳腺疾病患者中53例為纖維瘤，38例為脂肪瘤，排除患其它腫瘤的可能性。87例其它腫瘤患者中結腸癌31例、肺癌26例，卵巢癌30例。良性乳腺疾病患者、乳腺癌和其它腫瘤患者均于手術前1周內取晨血5 ml。對照組為同期健康女性體檢者45名(年齡27～75歲)。

1.2 試劑和儀器 逆轉錄反應體系、FQ-PCR反應體系和β-actin內對照試劑盒均來自美國ABI生物公司，7700 Sequence Detector 分析儀為美國ABI生物公司生產，cDNA標準品由上海申友公司合成。

1.3 FQ-PCR引物和探針 采用PE公司Primer Express軟件設計MUC1的引物和探針，引物和探針序列：MUC1 正義引物正向，5′-3′CGTCGTGGACATTGATGGTACC，MUC1反義引物，5′-3′ GGTACCTCCTCTCACCTCCTCCAA，β-actin引物：正向，5′-3′ctcttccagccttccttcct，反向，5′-3′ agcactgtgttggcgtacag，由上海基康生物公司合成。

1.4 FQ-PCR反應 ①取靜脈血5 ml，棄去開始的1 ml，以防上皮細胞的污染，1 mg/ ml EDTA抗凝，生理鹽水稀釋2～3倍，用淋巴細胞分離液分離出淋巴細胞，采用異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取細胞總RNA。②cDNA合成：逆轉錄反應體系20 μl，包括細胞總RNA 1 μg，隨機引物200 ng，RNasin 20 U，5×逆轉錄反應緩沖液4 μl，M-MLV反轉錄酶20U。42 ℃反應55 min。③PCR：反應體系逆轉錄產物5 μl，寡聚核苷酸引物各為400 nmol/L，探針150 nmol/L，dATP 、dCTP和dGTP各200 μmol/L，dUTP 400 μmol/L，10×緩沖液5 μl，MgCl25 mmol/L，Taq DNA聚合酶1.25U，尿嘧啶N-糖基化酶(UNG)0.5U。在7700 Sequence Detector 分析儀上測定標準品和標本MUC1和β-actin含量。擴增參數為：50 ℃2 min，95 ℃10 min；再94 ℃30 s，66 ℃1 min，40個循環，采用ABIfast 7500熒光分析儀進行測定。根據標準曲線，儀器自動計算出標本中MUC1和β-actin的拷貝數/ml，以MUC1和β-actin比值作為MUC1的表達水平。

1.5 陽性判斷 應用 2-ΔΔCt方法計算目的基因的相對表達量(Ct 為循環閾值)。ΔCt 值=目的基因(MUC1)Ct 值-β-actin 基因 Ct 值，以 β-actin 為對照；ΔΔCt =乳腺癌組的 ΔCt 值-健康體檢組的 ΔCt 值，以健康體檢組為對照。30例健康人的基因表達相對量為 1.003±0.087，2-ΔΔCt值為乳腺癌組基因相對健康體檢組基因表達的倍數，測定值以2-ΔΔCt>2 為表達陽性。陽性率=陽性表達人數/總人數×100%。

1.6 統計學方法 應用SPSS 17.0 軟件進行數據分析。MUCl陽性率的比較采用卡方檢驗。采用多因素logistic回歸分析檢驗MUC1癌基因表達與乳腺癌臨床病理因素的關系。P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 健康體檢者、良性乳腺疾病、其它腫瘤患者和乳腺癌患者MUC1陽性率比較 乳腺癌患者MUC1陽性率顯著高于健康體檢者、良性乳腺疾病和其它腫瘤患者(χ2分別為5.03，4.78，3.79，均P< 0.05)；良性乳腺疾病和其它腫瘤患者MUC1陽性率顯著高于健康體檢者(χ2分別為4.02，4.23，均P< 0.05)，而良性乳腺疾病和其它腫瘤患者MUC1陽性率差異無統計學意義(χ2=0.56，P> 0.05)，見表1。

表1 健康女性和乳腺疾病患者MUC1陽性率

2.2 MUC1癌基因表達與乳腺癌臨床病理因素的關系 以患者年齡、大小、類型和雌激素受體ER、孕激素受體PR的表達水平、乳腺癌臨床分期、組織學分級、腋淋巴結轉移和HER2/neu表達為自變量，以是否有MUC1 mRNA表達為因變量進行多元回歸分析，結果發現，乳腺癌臨床分期、組織學分級、腋淋巴結轉移和HER2/neu表達是MUC1 mRNA表達獨立相關因素(P< 0.05)；患者年齡、大小、類型和雌激素受體ER、孕激素受體PR的表達水平不是MUC1 mRNA表達獨立相關因素 (P> 0.05)，見表2。

表2 乳腺癌患者MUC1 mRNA表達陽性多因素回歸分析

3 討論

粘蛋白(MUC)是廣泛分布于機體正常黏膜表面的高分子量糖蛋白，迄今發現有13種(MUC1～MUC13)[1]。MUC1基因定位于染色體1q21，cDNA長1821bp，具有基因多態性。MUC1基因是通過篩選從乳腺癌、胰腺癌等細胞系構建的cDNA表達文庫克隆而得到的。MUC1基因的編碼產物MUC1粘蛋白是一種具有跨膜序列的附膜糖蛋白，其分子由肽核心和糖鏈組成。由于MUC1基因被成功克隆，發現MUC1在正常人體主要存在于胃腸道、呼吸道、泌尿生殖道及乳腺等多種上皮組織中，除有對正常的上皮起潤滑和保護作用，還有介導信號轉導和細胞粘附功能，免疫活化和抑制作用等[2]。而在乳腺腫瘤組織中MUC1多出現量和質的異常表達。因此，MUC1可能成為一種新的腫瘤標志物，用于乳腺癌的診斷、治療和預后判斷。

近年來，采用PCR方法檢測MUC1 mRNA表達有一些相關報道，Strati等發現，采用FQ-PCR檢測51例確診的轉移性乳腺癌的外周血，MUC1基因表達陽性率為45.1%[3]。Mana等報道，采用RT-PCR檢測60例乳腺癌患者外周血，MUC1 mRNA的表達陽性率為90.0%[4]。Cheng等報道，采用RT-PCR檢測34例轉移性乳腺癌外周血，MUC1 mRNA化療前后的陽性率分別為88.2%和70.6%[5]。

FQ-PCR是目前采用得較多的研究乳腺癌基因表達的分子學方法[6，7]，本試驗用FQ-PCR檢測了45名健康女性體檢者、91例良性乳腺疾病患者、87例其它腫瘤患者和193例乳腺癌患者的外周血中MUC1的基因表達，并以β-actin作為內對照，結果發現乳腺癌患者MUC1陽性率顯著高于健康體檢者、良性乳腺疾病和其它腫瘤患者，良性乳腺疾病和其它腫瘤患者MUC1陽性率顯著高于健康體檢者，良性乳腺疾病和其它腫瘤患者MUC1陽性率差異無統計學意義。

在與病理學特性的比較中，以患者年齡、大小、類型和雌激素受體ER、孕激素受體PR的表達水平、乳腺癌臨床分期、組織學分級、腋淋巴結轉移和HER2/neu表達為自變量，以是否有MUC1 mRNA表達為因變量進行多元回歸分析，結果發現，乳腺癌臨床分期、組織學分級、腋淋巴結轉移和HER2/neu表達是MUC1 mRNA表達獨立相關因素；患者年齡、大小、類型和雌激素受體ER、孕激素受體PR的表達水平不是MUC1 mRNA表達獨立相關因素。

綜上所述，FQ-PCR法能快速定量檢測外周血中MUC1的基因表達，具有高靈敏度、高特異性、高精確性、高效率和污染小等特點，而且標本來源容易，對于乳腺癌的診斷、治療和轉移提供更為可靠客觀的根據，是一種值得推薦的實驗室診斷方法。

[1] Williams SJ，Wreschner DH，Tran M，et al.MUC13：a novel humancell surface mucin expressed by epithelial and hemopoietic cell [J].J Biol Chem，2001，276(21)：18327-18336.

[2] Gendler SJ.MUC1，the renaissance molecule [J].J MammaryGland Biol Neoplasia，2001，6 (3)：339-353.

[3] Strati A，Parrella P，Copetti M，et al.Comparison between real-time quantitative PCR detection of HER2 mRNA copy number in peripheral blood and ELISA of serum HER2 protein for determining HER2 status in breast cancer patients[J].Cell Oncol，2009，31(3)：203-211.

[4] Mana O，Sacid B，Mohammad AM，et al.Molecular markers in peripheral blood of Iranian women with breast cancer[J].Cancer Microenviron，2012，6：109-116.

[5] Cheng JP，Yan Y，Wang XY，et al.MUC1-positive circulating tumor cells and MUC1 protein predict chemotherapeutic efficacy in the treatment of metastatic breast cancer[J].Chinese Journal of Cancer，2011，30(1)：54-61.

[6] 孫昌瑞，馮林，鄧君，等.聯合檢測乳腺癌易感基因1與Ccnd1 mRNA在乳腺癌診斷中的應用研究[J].實用醫院臨床雜志，2014，11(6)：67-69.

[7] 鄧君.細胞角蛋白19 聯合B 細胞淋巴瘤/白血病-2 基因mRNA 檢測診斷乳腺癌的臨床研究[J].實用醫院臨床雜志，2013，10(1)：70-72.

The application of SYBR GREEN fluorescent quantification polymerase chain reaction for the detection of human mammaglobin mRNA in the diagnosis of breast cancer

SUN Chang-rui1，DENG Jun1，FENG Lin2，HONG Hua1，JIANG Yong-mei3

(1.Clinical Laboratory，Sichuan Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial People’s Hospital，Chengdu 610072，China；2.Clinical Laboratory，Maternal and Child Health Hospital of Sichuan Province，Chengdu 610071，China；3.Clinical Laboratory，West China Second University Hospital，Sichuan University，Chengdu 610041，China)

DENGJun

Objective To investigate the application of SYBR GREEN fluorescent quantification polymerase chain reaction (SYBR GREEN FQ-PCR)to detect the MUC1 mRNA of circulating tumor cells in diagnosis and therapeutic monitoring of breast cancer.Methods With β-actin as internal control，MUC1 mRNA in peripheral blood cell samples in 45 health women，91 patients with benign breast disease and 193 patients with breast cancer and 87 with other cancer patients were detected by SYBR GREEN FQ-PCR.The relationship between MUC1 mRNA and clinicopathological parameters was analyzed.Results The positive rate of MUC1 mRNA detection in the patients with breast cancer was significantly higher than that in healthy individuals，patients with benign breast disease patients and other types of cancers (P< 0.05).The positive rate in the patients with benign breast disease and other types of cancers was significantly higher than that in the healthy individuals (P< 0.05).There was no significant difference in the positive rate between benign breast disease patients and other cancer patients (P>0.05).The independent factors of MUC1 mRNA expression were clinical stage，histological grade and axillary metastatic lymph node and HER2/neu (P<0.05).Conclusion FQ-PCR is a rapid and sensitive and specific method for quantitative detection of mucin1 mRNA.It can be used for the diagnosis，therapy，metastasis and prognosis of breast cancer.

SYBR Green；Polymerase chain reaction；Mucin1；Breast cancer

四川省杰出青年基金資助項目(編號：2007-5-345)；四川省衛生廳科研基金資助項目(編號：120112)

鄧 君

R446.62

A

1672-6170(2016)02-0054-03

2015-09-16；

2015-12-10)