幽門螺桿菌的細胞內感染及機制研究進展

高采平，韓盛璽

(四川省醫學科學院·四川省人民醫院消化內科，四川 成都 610072)

幽門螺桿菌的細胞內感染及機制研究進展

高采平，韓盛璽△

(四川省醫學科學院·四川省人民醫院消化內科，四川 成都 610072)

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H. pylori)是一種主要定植于人胃黏膜的革蘭氏陰性菌，與多種胃內外疾病密切相關，曾被認為是一種胞外致病菌，然而，越來越多的研究發現H. pylori可以進入細胞內存活、復制，可能為兼性胞內菌。而且，細胞內感染可能在H. pylori致病及耐藥方面起重要作用。本文回顧了H. pylori的細胞內感染及機制研究進展。

幽門螺桿菌；細胞外感染；細胞內感染；自噬異常

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H. pylori)是一種主要定植在人類胃黏膜小凹中、并能夠引起慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌以及胃黏膜組織相關淋巴瘤(MALT淋巴瘤)等嚴重病變的螺旋狀細菌。1983年，澳大利亞科學家Warren和Marshall首次從人類胃黏膜組織中分離培養出H. pylori[1]；1994年，H. pylori被世界衛生組織定義為Ⅰ類致癌原；2015年，《全球幽門螺桿菌京都共識意見》再次強調根除H. pylori感染可以預防胃癌發生[2]。H. pylori主要定植于人類胃小凹中、部分游離存在于胃黏液層或粘附在胃黏膜細胞表面，通過Ⅳ型分泌系統將毒力因子注入胃黏膜細胞內，曾經被認為是一種胞外致病菌。但是，越來越多的研究提示H. pylori可以進入上皮細胞、吞噬細胞內存活，可能為兼性胞內菌[3～7]。然而，關于H. pylori是否與腸道細菌一樣，如志賀氏桿菌、傷寒沙門氏菌等[8]，主要分布在細胞外和細胞表面，特定條件下進入細胞內引起持續性或復發性感染，目前尚不完全清楚。現就H. pylori的細胞內感染及相關機制研究進展綜述如下。

1 人體胃黏膜組織中，細胞內H. pylori感染

H. pylori感染的人體胃黏膜活檢組織，電鏡下觀察發現胃竇黏膜組織中的H. pylori主要分布在細胞連接處或粘附在細胞表面，但部分細胞內也可見到完整的H. pylori。Wyle等首先在透射電鏡下觀察到胃黏膜上皮細胞、壁細胞、主細胞內見到完整的H. pylori[9]。Bode和Ko等分別在腸化上皮細胞、基底細胞中也見到完成的H. pylori[10，11]。Noach等報道在電鏡下觀察到的231個H. pylori中，約71%的H. pylori游離存在于胃黏液中，約3%的H. pylori存在于上皮細胞內，其余的細菌粘附在細胞表面或部分被細胞膜包裹[12]；被細胞膜包裹的H. pylori可能進入細胞內。Ko和Chan等發現在胃黏膜活檢標本，有2%～6%的標本中發現細胞內有完整的H. pylori存在[11，13]。另外，H. pylori還可存在于腺體的底部和壁細胞的微管中[14]。

電鏡下觀察到細胞內H. pylori感染可能與H. pylori的根除療效有關。沒有細胞內H. pylor感染的患者根除率明顯高于胃黏膜底部有細菌感染或有細胞內細菌感染者[15]。盡管不同研究者均發現胃黏膜細胞內存在完整的H. pylori，但目前尚無證據表明人體組織中細胞內H. pylori是存活、復制的。

2 體外培養細胞中，細胞內H. pylori感染

在腸道細菌中，如志賀氏桿菌、傷寒沙門氏菌等，可以侵入腸黏膜上皮細胞內存活和繁殖，引起持續性或復發性感染[8]。大量研究觀察了H. pylori是否與腸桿菌一樣，可侵入細胞內存活并繁殖，結果發現在體外培養的上皮細胞、巨噬細胞、小鼠骨髓源性樹突狀細胞內雙層膜結構的自噬小體中存在活的H. pylori。在巨噬細胞中，Wang等觀察到H. pylori寄居于U937或THP-1細胞內雙層膜樣結構的自噬小體中，而且自噬小體的形成與H. pylori在細胞內的存活和復制密切相關，采用自噬激活劑雷帕霉素或抑制劑3-甲基腺嘌呤調控細胞自噬后，H. pylori在細胞內的復制水平受到影響[16]。Deen等采用免疫熒光共聚焦顯微鏡、投射電鏡等觀察到H. pylori被體外培養的THP-1、RAW264.7細胞吞噬進入細胞內，85%～95%的胞內細菌進入吞噬體內、小部分細菌游離在胞質中或存在于自噬體中[17]。在胃黏膜上皮來源細胞中，Amieva等采用微分干涉差光顯微鏡和免疫熒光顯微鏡在AGS細胞感染H. pylori后2～7小時均見到完整的細胞內細菌，采用H. pylori抗體染色證實為H. pylori；進一步動態觀察細胞內H. pylori的運動軌跡，發現細胞內空泡中H. pylori可以從細胞內運動到細胞外[4]。

很多細菌對大環內酯類藥物慶大霉素敏感，但慶大霉素不能滲透進入細胞內。因此，體外實驗中慶大霉素常用來清除細胞外和細胞表面感染敏感細菌，但對細胞感染內細菌無效。在體外培養的上皮細胞(AGS、HEK293)，巨噬細胞(THP-1、U937)中采用慶大霉素清除細胞外感染及粘附的H. pylori后，將細胞裂解進行H. pylori培養，仍能檢測到細胞內H. pylori生長[5，16，18]。H. pylori在細胞內可以存活72小時甚至更長時間[5，16，18]。體外培養的Hep-2細胞中球形變的H. pylori可以在胰蛋白酶消化傳代培養幾代后存活[19]。

3 細胞內H. pylori感染的機制

自噬異常是促進病原菌侵入細胞內存活、復制的的主要原因。在秀麗線蟲中自噬相關基因失活會引起鼠傷寒沙門氏菌在細胞內的復制[20]；在小鼠中干擾細菌感染自噬相關途徑將促進志賀氏桿菌在細胞內的復制[21]。自噬是細胞內的物質成分利用溶酶體被降解過程的統稱，是真核細胞所特有的生命現象，是生物在其發育、老化過程中都存在的一個凈化自身多余或受損細胞器的共同機制。

H. pylori感染也引起細胞自噬異常。H. pylori可能通過胞飲、酪氨酸激酶活化、肌動蛋白聚合、受體介導的胞吞作用侵入細胞內。人體胃黏膜組織中，細胞內H. pylori存在于空泡中，與自噬相關的溶酶體樣結構相鄰[10]。體外培養細胞中，Terebiznik等[19]首先報道H. pylori感染AGS細胞后可誘導細胞發生自噬，即在投射電鏡下觀察到自噬小體存在，自噬標記蛋白LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉變，以及熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光蛋白標記的LC3(GFP-LC3)向自噬小體聚集。該過程依賴宿主的自噬蛋白Atg5 和Atg12，Atg5 和Atg12 敲除的細胞在感染H. pylori后，出現GFP-LC3 熒光斑點的數量減少和LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉變減少[19]。而且，在自噬缺陷的細胞模型中，細胞內H. pylori存活數量更多[22]。

進一步研究發現，細胞內H. pylori感染后，宿主細胞的自噬功能異常是H. pylori在細胞內存活的主要原因。H. pylori侵入細胞時，數十個與自噬囊泡形成、延展、成熟相關的分子表達異常，包括AKT1、MBRA1、APP、ATG16L1、ATG16L2、ATG3、ATG4B、ATG4C、ATG4D、ATG5、ATG7、BAD、BAX、BCL2L1、BECN1等表達降低，而CTSS、GABARAPL1、MAP1LC3B、NFKB1、SQSTM1、TNF的表達增加[23]。H. pylori感染后，微RNA30B表達上調導致其靶基因自噬相關蛋白Atg12和BECN1表達下降，誘導細胞發生自噬[18]。細菌脂多糖刺激細胞引起BECN1蛋白泛素化，使BECN1與BCL2解離從而誘導巨噬細胞發生自噬[24]，延遲吞噬后同型吞噬體融合[25]，阻止巨噬細胞內吞噬體的成熟[26]。H. pylori感染ATG16L1型宿主后，ATG16L1與NOD2受體相互作用募集自噬相關蛋白包繞入侵的細菌形成自噬小體、肽聚糖脫乙酰酶通過調節細胞NOD2受體通路，誘導產生的自噬小體中缺乏降解底物的組織蛋白酶D，使得功能缺陷的自噬小體不斷蓄積，并成為H. pylori在細胞內存活和復制的庇護所(圖1)[22]。H. pylori進入上皮細胞或巨噬細胞后可能出現三種結局:① 誘導細胞自噬，并在自噬體中被降解[5，16，19]；②下調自噬相關蛋白表達，逃逸自噬[17，18，22，25]；③ 利用自噬體為自身復制提供庇護所[4，5，7，16]。

圖1 H. pylori感染后進入細胞內存活的可能機制[21]

體外研究顯示vacA基因缺陷的突變型菌株及其無菌培養上清感染細胞后均不能形成自噬小體，提示VacA對H. pylori感染誘導的細胞自噬是必不可少的，而細菌的其他毒力因子如細胞毒素相關蛋白(CagA)、尿素酶，則無明顯影響[21]。目前發現，影響H. pylori侵入細胞內存活的因素還包括體外培養細胞液中肽牛血清的濃度、宿主基因ATG16L1型等位基因突變可能促進H. pylori進入細胞[22]。

4 小結

H. pylori感染的患者和體外培養細胞中均發現H. pylori的細胞內感染，提示H. pylori可能為兼性胞內感染細菌。H. pylori在細胞內存活和復制可能是機體免疫反應和抗菌素無法將其徹底清除的原因之一，然而其確切機制仍不完全清楚。我國是H. pylori感染和胃癌的高發地區。盡管治療H. pylori感染的方案越來越復雜，療程也從7天延長到14天，即使是敏感抗菌素也可能出現治療失敗。細胞內感染可能在H. pylori感染所致的胃癌發生以及根除治療失敗中起重要作用，有待進一步深入研究。

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Advances in intracellular infection of helicobacter pylori

GAO Cai-ping，HAN Sheng-xi

國家自然科學基金青年項目(編號:81001083/H1617))

R573.6

B

1672-6170(2016)02-0171-03

2015-12-18；

2016-01-10)

△通訊作者