葡萄糖脫氫酶溫控表達菌株的構建及其發酵工藝

李 楊，張志萌，董自星，王正祥，路福平

（工業發酵微生物教育部重點實驗室，工業酶國家工程實驗室，天津市工業微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

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葡萄糖脫氫酶溫控表達菌株的構建及其發酵工藝

李 楊，張志萌，董自星，王正祥，路福平

（工業發酵微生物教育部重點實驗室，工業酶國家工程實驗室，天津市工業微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

摘 要：膜結合型的吡咯喹啉醌依賴性葡萄糖脫氫酶（mPQQGDH，EC 1.1.5.2）是一種重要的氧化還原酶，因其在血糖診斷及葡萄糖傳感器中的重要應用而受到廣泛的關注.但是其低表達水平限制了這種酶的大規模工業化生產及應用.本文利用λ噬菌體的溫敏型啟動子PL-PR替換葡萄糖脫氫酶基因的啟動子，構建了重組菌大腸桿菌（E. coli）B0013-120/pGCd：：Km-PL-PR，并使重組菌的酶活比原始菌株提高了21.2%，.再通過發酵條件的優化，確定了mPQQGDH的最適誘導表達條件為：以甘油為碳源、誘導溫度42，℃、誘導時間4，h、誘導前菌體密度A600=1.6.最后對該酶的酶學性質進行了分析，其最適反應溫度和pH分別為25，℃和6.0，所得mPQQGDH的熱穩定性在45，℃條件下可維持穩定的活性.這為葡萄糖脫氫酶更廣泛的應用及工業化生產奠定了基礎.

關鍵詞：葡萄糖脫氫酶；溫敏型啟動子；高效表達；發酵工藝優化

數字出版日期：2015-10-16；數字出版網址：http://www.cnki.net/kcms/detail/12.1355.N.20151016.1454.010.html.

大腸桿菌葡萄糖脫氫酶（mPQQGDH，EC 1.1.5.2）是一種膜結合型醌蛋白，位于細胞膜外表面.在醌式輔酶吡咯喹啉醌（PQQ）的存在下能特異性催化葡萄糖生成葡萄糖酸.1975年，Banauch 等就提出利用上述反應，采用動態法或終點法分析測定人體體液中的葡萄糖濃度［1］.近年來，以葡萄糖脫氫酶特異性反應為基礎制成的血糖檢測儀和生物芯片已廣泛應用于醫療診斷和人體保健檢測等領域［2-3］.

啟動子是基因表達調控的一種重要順式作用元件，它一般具有序列特異性、位置特異性、種屬特異性、方向性等幾個明顯的特征［4］.tac啟動子能夠以乳糖或IPTG作為誘導劑誘導重組蛋白表達，成本較高，不適用于大規模工業化生產.而λ 噬菌體啟動子PL和PR能夠通過改變培養溫度快速、有效地開啟或關閉重組蛋白的表達［5］.而且已被用于多種目的產物的表達，具有顯著優勢［6］.此外，λ 噬菌體啟動子還具有作為代謝調控基因開關的潛在應用價值［7］.本實驗室通過引入溫度開關（λ 噬菌體啟動子）改變原有菌株代謝途徑，使發酵前期獲得足夠的菌體量，再通過溫度調節轉入后續發酵，將代謝產物D-乳酸的產量提高了66%，［8-9］.

因此，本研究通過將大腸桿菌葡萄糖脫氫酶基因（gcd）的啟動子替換為λ 噬菌體啟動子PL-PR，引入溫度誘導型轉錄系統，改變了酶合成表達的誘導方式；找出在此表達系統下菌株的最適生長溫度及葡萄糖脫氫酶的最適表達溫度.通過搖瓶發酵實驗，優化了相應的發酵條件，為后續生物法發酵生產葡萄糖脫氫酶提供相關實驗數據支持.

1　材料與方法

1.1菌株與質粒

本實驗所使用的菌株與質粒見表1.

表1　菌株和質粒Tab.1　Strains and plasmids used in this study

1.2引物列表

本實驗所使用的引物見表2，序列中的下劃線部分為酶切位點.

表2　引物序列Tab.2　Primer sequences

1.3試劑與培養基

限制性內切酶（Pst Ⅰ、BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ、XhoⅠ）、T4，DNA連接酶、DNA聚合酶和dNTPs均購自TaKaRa公司；其他藥品和試劑均為分析純.

LB培養基（g/L）：酵母浸出物5，胰蛋白胨10，NaCl 10，用去離子水溶解并定容.1×105，Pa滅菌20，min.固體培養基加入2%，瓊脂.

M9培養基（g/L）：Na2HPO4·12H2O 15.113，KH2PO43，NH4，Cl 1，NaCl 1，用去離子水溶解并定容.每升 M9 液體培養基補加1，mL 1，mol/L MgSO4和1，mL微量元素母液.微量元素母液成分（g/L）：FeCl3·6H2O 2.400，CoCl2·6H2O 0.300，CuCl2·2H2O 0.150，ZnCl20.300，Na2MoO4·2H2O 0.300，H3BO30.075，MnCl2·4H2O 0.495.

1.4葡萄糖脫氫酶基因gcd的擴增

根據GenBank中大腸桿菌（E.coli）K12的gcd基因序列設計兩條特異性引物：Gcd-1與Gcd-2.提取E.coli K12的基因組DNA作為擴增模板，擴增葡萄糖脫氫酶基因序列.PCR反應體系（50，μL）：基因組DNA 1，μL，10×buffer 5，μL，25，mmol/L dNTP 4，μL，LA Taq DNA聚合酶0.5，μL，10，mmol/L上、下游特異性引物各2，μL，ddH2O 37.5，μL.反應條件：94，℃ 5，min；94，℃ 45，s，58，℃ 45，s，72，℃ 1，min，30個循環；72，℃ 10，min.將PCR產物進行回收純化，與線性化的pMD19-T載體連接，轉化E.coli JM109感受態，涂布于含有氨芐青霉素的LB平板上，提取質粒酶切驗證.

1.5重組菌株的構建

用引物pPL3和pPL4，并以質粒pPL-Km為模板，按照上述PCR體系與條件擴增得PL-PR啟動子，回收純化PCR產物并用EcoR I和EcoR V雙酶切得到酶切產物（2.4，kbp）.以重組質粒pMD19-T-gcd為模板，設計引物Gcd-3f和Gcd-4r，進行反向PCR，PCR產物為3.5，kbp，并用T4多聚核苷酸激酶對其產物平末端磷酸化.將PL-PR啟動子序列與反向PCR產物進行連接構建重組質粒pGCd：：Km-PL-PR，轉化E.coli JM109，涂布于含有卡那霉素的LB平板上，提取質粒并用Pst Ⅰ酶切驗證得到5.2，kbp和0.7，kbp兩條條帶.

用重組質粒pGCd：：Km-PL-PR的質粒DNA作為模板，以Gcd-1和Gcd-2為引物，利用上述反應體系和條件（1.4部分）進行PCR擴增，擴增出pGCd：：Km-PL-PR基因片段.電擊轉化（1，800，V，5，ms）含有輔助質粒pKD46并經2，mmol/L L-阿拉伯糖誘導的目的菌株 B0013-080C，在卡那霉素抗性平板篩選轉化子.挑取陽性轉化子，以D-gcd1和D-gcd2為引物，進行菌落PCR驗證.

1.6重組菌株的誘導表達

分別挑取菌株B0013-120/pKD46以及重組菌株B0013-120/pGCd：Km-PL-PR的單菌落于50，mL LB培養基中，30，℃、200，r/min 培養過夜.以2%，的接種量接種于50，mL含有5，g/L葡萄糖的M9液體培養基中，以30，℃、200，r/min培養2，h后，以42，℃、200，r/min誘導培養4，h.8，000，r/min離心10，min，去除上清液，制成粗酶液，測定葡萄糖脫氫酶酶活.

1.7葡萄糖脫氫酶酶活測定［10］

D-Glucose+ox-PMS→D-glucono-5-lactone+

re-PMS

re-PMS+ox-DCIP→ox-PMS+re-DCIP氧化態的2，6-二氯靛酚（DCIP）溶液為藍色，在600，nm處有吸光度，而還原態的DCIP溶液為無色.因此當反應進行時，藍色會慢慢褪去，相應的A600值會逐漸減小，通過A600值的變化對酶活進行測定計算.

酶活單位（U）：25，℃條件下，在1，min內能夠使1，μmol的葡萄糖氧化（或1，μmol DCIP還原）的酶量.

酶活測定：50，mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），20，mmol/L葡萄糖，0.75，mmol/L PMS，0.75，mmol/L DCIP和10，μL適當稀釋的酶液.將反應試劑母液依次加入到1，cm比色皿中混合均勻，在25，℃下進行反應，開始計時，通過UV-9100型分光光度計讀取記錄下第1，min和3，min的A600.空白對照：50，mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），20，mmol/L 葡萄糖，0.75，mmol/L吩嗪硫酸甲酯（PMS），0.75，mmol/L DCIP和10，μL去離子水.將反應試劑母液依次加入到1，cm比色皿中混合均勻，在25，℃下進行反應，開始計時，通過UV-9100型分光光度計讀取記錄下第0，min和3，min的A600.酶活按照式（1）進行計算.式中：A測定和A空白分別為600，nm下酶活測定和空白對照的吸光度；Vt為體系體積，2，mL；tmin為反應時間，3，min；Vs為加入的酶液體積，0.02，mL；df為酶液稀釋倍數.

1.8誘導條件對重組葡萄糖脫氫酶表達的影響

1.8.1培養基碳源對重組葡萄糖脫氫酶表達的影響

本文選用甘油和葡萄糖兩種常用碳源進行對比分析，分別挑取菌株B0013-120/pKD46以及轉化子B0013-120/pGCd：：Km-PL-PR的單菌落于50，mL LB液體培養基中，30，℃、200，r/min 培養過夜.以2%，的接種量接種于50，mL 分別以甘油（終質量濃度為5，g/L）和葡萄糖（終質量濃度為5，g/L）為唯一碳源的M9液體培養基中，30，℃、200，r/min 培養2，h后，以42，℃、200，r/min誘導培養4，h.8，000，r/min離心10，min收集菌體，測定葡萄糖脫氫酶酶活.

1.8.2誘導溫度對葡萄糖脫氫酶表達的影響

分別將菌株B0013-120/pKD46以及重組菌株B0013-120/pGCd：：Km-PL-PR按照1.8.1的培養方式進行過夜培養.以2%，的接種量接種于含有上述最佳碳源的50，mL M9 液體培養基中，30，℃、200，r/min培養至菌體密度為A600=1.0時，添加0.5%，酵母膏，分別在30、37、42，℃以及200，r/min誘導4，h后測定酶活.

1.8.3誘導前菌體密度對葡萄糖脫氫酶表達的影響

分別將菌株B0013-120/pKD46以及重組菌株B0013-120/pGCd：：Km-PL-PR按照1.8.2的培養方式培養至菌體密度分別為A600=1.0、1.3、1.6、2.0時，添加0.5%，的酵母膏于最佳誘導溫度下誘導4，h.收集菌體，用ddH2O清洗菌體后，收集30，mL菌體，添加約1，mL ddH2O（使每管菌體菌體密度一致）混勻并添加終濃度5，μmol/L PQQ和終濃度為1，mmol/L的Mg2+，25，℃孵育30，min，測定酶活.

1.8.4誘導時間對葡萄糖脫氫酶表達的影響

按上述最佳培養條件，分別將菌株B0013-120/pKD46以及重組菌株B0013-120/pGCd：：Km-PL-PR培養至最佳菌體密度，添加0.5%，的酵母膏，分別在最佳誘導溫度下誘導1、2、3、4，h.收集菌體，用ddH2O清洗菌體后，收集30，mL菌體，添加約1，mL ddH2O（使每管菌體菌體密度一致）混勻并添加5，μmol/L PQQ和終濃度為1，mmol/L的Mg2+，25，℃孵育30，min.測定酶活.

1.9葡萄糖脫氫酶酶學性質分析

1.9.1葡萄糖脫氫酶的最適反應溫度

制備粗酶液并添加5，μmol/L PQQ和終濃度為1，mmol/L的Mg2+，分別于15、20、25、30、35、42、50，℃孵育30，min.測定酶活，確定其最適反應溫度.

1.9.2葡萄糖脫氫酶的熱穩定性

將粗酶液分別于45、50、55、60、65，℃水浴鍋中進行孵育，每10，min取樣1次，立即置于冰上2，min，室溫恢復30，min.測定酶活.

1.9.3葡萄糖脫氫酶的最適反應pH

制備粗酶液并添加5，μmol/L PQQ和終濃度為1，mmol/L的Mg2+，于25，℃孵育30，min.分別在pH 為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的緩沖體系（0.2，mol/L磷酸二氫鈉和0.3，mol/L磷酸氫二鈉緩沖液）中測定酶活，分析其最適反應pH.

2　結果與分析

2.1重組菌株的構建

按照1.3、1.4的方法擴增出完整的gcd基因序列，經過凝膠電泳檢測在0.9，kbp左右有明顯條帶（圖1），與gcd序列大小一致.

圖1　 gcd基因的PCR產物Fig.1　Products of gene gcd after PCR

擴增出PL-PR啟動子與卡那霉素抗性基因的序列經電泳檢測，在約3.5，kbp有明顯條帶，大小相符.將兩段序列進行連接轉化至大腸桿菌感受態中，獲得含有卡那霉素抗性序列的重組質粒pGCd：：Km-PL-PR，PstⅠ酶切條帶為0.7，kbp和5.2，kbp.以該重組質粒為模板，擴增出大小為3.2，kbp的pGCd：：Km-PL-PR基因片段.將該片段電轉至菌株B0013-120/pKD46的感受態細胞中，從而得到重組菌株B0013-120/pGCd：：Km-PL-PR.提取該菌株的染色體，以引物D-gcd1和Gcd-2進行PCR驗證，結果得到3.2，kbp的目的條帶，如圖2所示.

圖2　重組菌株B0013-120/pGCd：：Km-PL-PR的 PCR驗證Fig.2　PCR verification of the recombined vector B0013-120/pGCd：：Km-PL-PR

2.2重組菌的誘導表達

按照1.5的誘導方法，將得到的重組菌株B0013-120/pGCd：：Km-PL-PR與原始菌株B0013-120/ pKD46轉接搖瓶中進行誘導后，分別測定其酶活，發現對照菌和重組菌的酶活分別為（52±2）U/mL、（63±6）U/mL（圖3）.

圖3　 重組菌的葡萄糖脫氫酶酶活Fig.3　Assay of the enzymatic activity of the engineered strains

在相同條件下，重組菌酶活力高于原始菌酶活力.這是因為重組菌株B0013-120/pGCd：：Km-PL-PR使用溫控開關替換了原始啟動子，pPL451 具有λ噬菌體啟動子PL和PR，在低溫（28～30，℃）下生長時，cIts857基因表達的λ抑制物可以抑制該啟動子的轉錄，當細胞生長至適宜菌體濃度時，進行42，℃培養可使λ抑制物快速失活.從而啟動子恢復轉錄功能，進而表達蛋白.

2.3誘導條件對重組葡萄糖脫氫酶表達的影響

培養基中豐富的營養供給對細胞生長極為有利，使誘導前細胞密度達到一個較高值，可為溫度誘導目標蛋白的高水平表達奠定良好的基礎.此外，mPQQGDH作為一種膜蛋白，其表達量在一定程度上與菌體密度成正相關，因此提高菌體密度有利于膜蛋白產量的提高.M9培養基作為mPQQGDH的表達培養基，其氮源和微量元素非常豐富，但需要外源添加碳源.

分別以10%，甘油和葡萄糖作為碳源，它們對重組菌內葡萄糖脫氫酶表達的影響如圖4所示.從圖4可以看出，重組菌株在以甘油為碳源的培養基中葡萄糖脫氫酶的表達量較葡萄糖為碳源的培養基的高17，U/mL，表明甘油更適合作為重組菌表達的培養基碳源.

圖4　 碳源對葡萄糖脫氫酶酶活的影響Fig.4　Influence of carbon sources on the enzymatic activity

以10%，甘油作為碳源，分別在30、37、42，℃的條件下對重組菌和原始菌進行誘導，比較誘導溫度對葡萄糖脫氫酶表達的影響，結果如圖5所示.30，℃誘導時，重組菌的酶活反而低于原始菌，37，℃誘導時，重組菌與原始菌的酶活差別不大，而42，℃誘導時，重組菌酶活為60，U/mL大于原始菌的酶活47，U/mL.這說明42，℃是重組菌的最適誘導溫度.

分別將原始菌和重組菌轉接搖瓶培養至菌體密度分別達到A600=1.0、1.3、1.6、2.0時，在42，℃條件下進行誘導后，分別測定其酶活，結果如圖6所示.由圖6可知，在菌體密度為A600=1.6時，蛋白表達量最高.其原因可能是菌體密度達到一定程度時膜蛋白表達較高，但菌體密度過高的情況下，菌體老化等原因可能會對細胞有一定的毒害作用.因此，選取菌體密度為A600=1.6時進行誘導.

圖5　 誘導溫度對酶活的影響Fig.5　Influence of induction temperature on the enzymatic activity

圖6　 誘導前菌體密度對酶活的影響Fig.6　Influence of optical density before induction on the enzymatic activity

分別將原始菌和重組菌轉接搖瓶培養至菌體密度分別達到A600=1.6時，在42，℃條件下誘導1、2、3、4，h后，測定其酶活，其結果如圖7所示.誘導時間為4，h時，酶活力最高.因此，選取誘導時間為4，h，以得到最高產酶量.

圖7　 誘導時間對酶活的影響Fig.7　Influence of induction time on the enzymatic activity

誘導溫度以及誘導時間對重組蛋白的大量表達也有很大的影響.在升溫誘導的后期，重組蛋白的大量表達和高溫誘導條件下的熱誘導會產生熱休克蛋白（37，℃條件即可產生）［11］.而這些熱休克蛋白中含有許多蛋白水解酶［12］，會降解部分重組蛋白，從而使得升溫誘導一段時間后mPQQGDH的活性下降.持續的高溫誘導和重組蛋白的大量表達除了促進包涵體形成之外，也會引起大腸桿菌的應急反應（SOS response）.這種應急反應會誘導宿主菌表達Rec-A蛋白［13］，它會和溫度起到協同作用共同裂解cIts857阻遏蛋白，進一步促使PL-PR啟動子的高效轉錄.經實驗證明，在42，℃的溫度條件下誘導4，h，能得到酶活較高的mPQQGDH.

2.4葡萄糖脫氫酶酶學性質分析

2.4.1葡萄糖脫氫酶的最適孵育溫度

在不同的溫度（15、20、25、30、35、42、50，℃）下測定酶活，以溫度為橫坐標，相對酶活為縱坐標繪制曲線，結果如圖8所示.結果表明：葡萄糖脫氫酶的最適反應溫度為25，℃.

圖8　 孵育溫度對相對酶活的影響Fig.8　Influence of incubation temperature on the relative enzymatic activity

2.4.2葡萄糖脫氫酶的熱穩定性

熱穩定性的研究表明（圖9），mPQQGDH在45，℃條件下比較穩定，而在55，℃條件下半衰期為20，min，在65，℃、20，min酶活力僅為6，U/mL，而75，℃可直接導致酶的失活.與吡咯喹啉醌型水溶性葡萄糖脫氫酶（sPQQGDH）一樣，具有熱穩定性差的特點.后續研究中可以采用定點突變等方法提高其熱穩定性.比如，Sode等［14］利用linker將PQQGDH-B的兩個亞基連起來，使該酶在55，℃孵育20，min后殘留的酶活提高了1倍，達到40%，以上.

2.4.3葡萄糖脫氫酶的最適測定pH

將葡萄糖脫氫酶粗酶液分別在不同pH的緩沖體系中測定酶活，以pH為橫坐標，相對酶活為縱坐標繪制曲線，結果如圖10所示，葡萄糖脫氫酶的最適測定pH為6.0.

圖9　 酶的熱穩定性Fig.9　Thermal stability of the enzyme

圖10　 pH對相對酶活的影響Fig.10　Influence of pH on the relative enzymatic activity

3　結 語

由于大腸桿菌具有遺傳背景清楚、表達體系穩定以及大規模發酵經濟等優點，常用作外源基因表達的高效宿主，也是獲得外源基因穩定高效表達的較好選擇.IPTG是tac啟動子常用的誘導物，但其具有毒性且價格昂貴，不適用于工業化生產.本文利用溫敏型啟動子PL-PR替換葡萄糖脫氫酶原有的啟動子，通過溫度的變化對其進行誘導控制，節省了添加誘導劑的成本及步驟，使發酵過程更簡便.此外，優化了搖瓶發酵條件并研究了葡萄糖脫氫酶的酶學性質，這為其工業化生產及更廣泛的應用奠定了基礎.

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責任編輯：郎婧

Construction of a Recombined Bacterium for the Thermo-regulated Expression of Glucose Dehydrogenase and the Optimization of the Fermentation Process

LI Yang，ZHANG Zhimeng，DONG Zixing，WANG Zhengxiang，LU Fuping

（Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes，Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China）

Abstract：Membrane-bound pyrroloquinoline quinine-dependent glucose dehydrogenase（mPQQGDH，EC1.1.5.2）is a significant kind of oxidoreductase，and has received considerable attention for its wide application in the fields of clinical diagnosis and industrial glucose sensors.However，the low expression level limits its mass industrial production and application scope.In this study，temperature sensitive promoter PL-PRwas used to replace the promoter of mPQQGDH，resulting in a recombined bacterium E.coli B0013-120/pGCd：：Km-PL-PRwhose glucose dehydrogenase activity was 21.2%， higher than that of the original strain.Subsequently，the fermentation conditions were optimized to determine the suitable carbon source，induction temperature，optical density before induction and the induction time for the expression of mPQQGDH. Finally，by characterizing the enzymatic properties of this enzyme，the temperature and pH optima were determined to be 25，℃ and 6.0，respectively，and this enzyme was stable at 45，℃.These results can lay a solid foundation for the wider range of application and industrial production of mPQQGDH.

Key words：glucose dehydrogenase；temperature sensitive promoter；overexpression；fermentation process optimization

中圖分類號：Q93

文獻標志碼：A

文章編號：1672-6510（2016）02-0013-07

收稿日期：2015-05-06；修回日期：2015-06-02

基金項目：國家高技術研究發展計劃（863計劃）資助項目（2013AA102106-07）

作者簡介：李 楊（1988—），女，天津人，碩士研究生；通信作者：路福平，教授，lfp@tust.edu.cn.

DOI:10.13364/j.issn.1672-6510.20150057